Klíčový rozdíl – NGS vs Sanger Sequencing
Sekvenování nové generace (NGS) a Sangerovo sekvenování jsou dva typy technik sekvenování nukleotidů vyvinuté v průběhu času. Sangerova metoda sekvenování byla po mnoho let široce používána a NGS ji pro její výhody nedávno nahradila. Klíčový rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním je v tom, že NGS funguje na principu rychlého sekvenování milionů sekvencí současně prostřednictvím sekvenačního systému, zatímco Sangerovo sekvenování funguje na principu ukončení řetězce díky selektivnímu začlenění dideoxynukleotidů enzymem DNA polymerázou. během replikace DNA a výsledné separace fragmentů kapilární elektroforézou.
Co je sekvenování nukleotidů?
Genetická informace je uložena v nukleotidových sekvencích DNA nebo RNA organismu. Proces stanovení správného pořadí nukleotidů (pomocí čtyř bází) v daném fragmentu (v genu, shluku genů, chromozomu a kompletním genomu) je známý jako sekvenování nukleotidů. V genomických studiích, forenzních studiích, virologii, biologické systematice, lékařské diagnostice, biotechnologii a v mnoha dalších oblastech je velmi důležité analyzovat strukturu a funkci genů. Vědci vyvinuli různé typy sekvenačních metod. Mezi nimi, Sangerovo sekvenování vyvinuté Frederickem Sangerem v roce 1977 bylo široce používáno a popularizováno po dlouhou dobu, dokud ho Next Generation Sequencing nenahradilo.
Co je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je termín používaný k označení moderních vysoce výkonných sekvenačních procesů. Popisuje řadu různých moderních sekvenačních technologií, které způsobily revoluci v genomických studiích a molekulární biologii. Těmito technikami jsou sekvenování Illumina, sekvenování Roche 454, sekvenování iontových protonů a sekvenování SOLiD (sekvenování pomocí Oligo Ligation Detection). Systémy NGS jsou rychlejší a levnější. V systémech NGS se používají čtyři hlavní metody sekvenování DNA, a to; pyrosekvenování, sekvenování syntézou, sekvenování ligací a sekvenování iontových polovodičů. Velké množství řetězců DNA nebo RNA (miliony) může být sekvenováno paralelně. Umožňuje sekvenování celého genomu organismů v krátkém časovém období, na rozdíl od Sangerova sekvenování, které zabere více času.
NGS má mnoho výhod oproti konvenční sekvenační Sangerově metodě. Jedná se o vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivní proces, který lze provádět s malou velikostí vzorku. NGS lze použít v metagenomických studiích, při detekci variací v rámci jednotlivého genomu v důsledku inzercí a delecí atd. a při analýze genových expresí.
Obrázek_1: Vývoj v sekvenování NGS
Co je Sangerovo sekvenování?
Sangerovo sekvenování je sekvenační metoda vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení přesného nukleotidového pořadí daného fragmentu DNA. Je také známá jako sekvenování zakončení řetězce nebo Dideoxy sekvenování. Principem této metody je ukončení syntézy řetězce selektivním začleněním dideoxynukleotidů ukončujících řetězec (ddNTP), jako jsou ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocí DNA polymerázy během replikace DNA. Normální nukleotidy mají 3'OH skupiny pro vytvoření fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy, aby pokračovala tvorba vlákna. Nicméně ddNTP postrádají tuto 3' OH skupinu a nejsou schopny tvořit fosfodiesterové vazby mezi nukleotidy. Tím se zastaví prodlužování řetězu.
V této metodě slouží jednořetězcová DNA, která má být sekvenována, jako templátový řetězec pro syntézu DNA in vitro. Dalšími požadavky jsou oligonukleotidový primer, deoxynukleotidové prekurzory a enzym DNA polymeráza. Když jsou známy lemující konce cílového fragmentu, primery mohou být snadno navrženy pro replikaci DNA. Ve čtyřech samostatných zkumavkách se provádějí čtyři samostatné reakce syntézy DNA. Každá zkumavka má samostatné ddNTP spolu s dalšími požadavky. Z konkrétního nukleotidu se přidá směs dNTP a ddNTP. Podobně se provádějí čtyři samostatné reakce ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi. Po reakcích se provádí detekce fragmentů DNA a konverze vzoru fragmentů na sekvenční informace. Výsledné fragmenty DNA jsou tepelně denaturovány a separovány gelovou elektroforézou. Pokud jsou použity radioaktivní nukleotidy, může být pruhovaný vzor v polyakrylamidovém gelu vizualizován autoradiografií. Když tato metoda používá fluorescenčně značené dideoxynukleotidy, může být zmírněna odečtením gelu a projde paprskem laseru, aby byl detekován fluorescenčním detektorem. Aby se předešlo chybám, které by mohly nastat, když je sekvence čtena okem a zadávána ručně do počítače, vyvinula se tato metoda v použití automatického sekvenceru spojeného s počítačem.
Toto je metoda používaná k sekvenování DNA z projektu Human Genome. Tato metoda se stále používá s pokročilými úpravami, protože poskytuje přesné informace o sekvenci, přestože je to drahý a pomalý proces.
Figure_2: Sanger Sequencing
Jaký je rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) označují moderní vysoce výkonné sekvenační procesy. Popisuje řadu různých moderních technologií sekvenování | Sangerovo sekvenování je sekvenační metoda vyvinutá Frederickem Sangerem k určení přesného pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. |
| Nákladová efektivita | |
| NGS je levnější proces, protože snižuje čas, lidskou sílu a chemikálie. | Toto je nákladný proces, protože vyžaduje čas, lidskou sílu a více chemikálií. |
| Speed | |
| Je to rychlejší, protože chemická detekce i detekce signálu mnoha vláken probíhají paralelně. | To je časově náročné, protože chemická detekce a detekce signálu probíhají jako dva samostatné procesy a číst lze současně pouze na řetězci. |
| Spolehlivost | |
| NGS je spolehlivý. | Sangerovo sekvenování je méně spolehlivé |
| Velikost vzorku | |
| NGS vyžaduje menší množství DNA. | Tato metoda vyžaduje velké množství templátové DNA. |
| Báze DNA na sekvenovaný fragment | |
| Počet bází DNA na sekvenovaný fragment je nižší než u Sangerovy metody | Generování sekvencí je delší než sekvence NGS. |
Shrnutí – NGS vs Sanger Sequencing
NGS a Sangerovo sekvenování jsou techniky sekvenování nukleotidů široce používané v molekulární biologii. Sangerovo sekvenování je raná sekvenační metoda, která byla nahrazena NGS. Hlavní rozdíl mezi NGS a Sangerovým sekvenováním je ten, že NGS je vysokorychlostní, přesnější a nákladově efektivnější proces než Sangerovo sekvenování. Obě techniky způsobily velké propuknutí v genetice a biotechnologii.
