Klíčový rozdíl – Sangerovo sekvenování vs pyrosekvenování
Sekvenování DNA je pro analýzu DNA velmi důležité, protože znalost správného uspořádání nukleotidů v konkrétní oblasti DNA o ní odhaluje mnoho důležitých informací. Existují různé metody sekvenování DNA. Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě různé metody sekvenování DNA široce používané v molekulární biologii. Klíčový rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním je v tom, že Sangerovo sekvenování používá dideoxynukleotidy k ukončení syntézy DNA ke čtení nukleotidové sekvence, zatímco pyrosekvenování detekuje uvolňování pyrofosfátů začleněním nukleotidů a syntetizací komplementární sekvence pro přečtení přesného pořadí sekvence.
Co je Sangerovo sekvenování?
Sangerovo sekvenování je metoda sekvenování DNA první generace vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho vysokými školami v roce 1977. Je také známá jako sekvenování zakončení řetězce nebo Dideoxy sekvenování, protože je založeno na terminaci řetězce dideoxynukleotidy (ddNTP). Tato metoda byla široce používána více než 30 let, dokud nebylo vyvinuto sekvenování nové generace (NGS). Technika Sangerova sekvenování umožnila objev správného pořadí nukleotidů nebo připojení konkrétního fragmentu DNA. Je založen na selektivní inkorporaci ddNTP a ukončení syntézy DNA během in vitro replikace DNA. Absence 3' OH skupin pro pokračování tvorby fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy je jedinečnou vlastností ddNTP. Jakmile je tedy ddNTP připojen, prodlužování řetězce končí a končí od tohoto bodu. V Sangerově sekvenování se používají čtyři ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tyto nukleotidy zastaví proces replikace DNA, když jsou začleněny do rostoucího řetězce DNA a vedou k různě dlouhé krátké DNA. Kapilární gelová elektroforéza se používá k uspořádání těchto krátkých řetězců DNA podle jejich velikostí na gelu, jak je znázorněno na obrázku 01.
Obrázek 1: Kapilární gelová elektroforéza syntetizované krátké DNA
Pro replikaci DNA in vitro by mělo být uvedeno několik požadavků. Jsou to enzym DNA polymeráza, templátová DNA, oligonukleotidové primery a deoxynukleotidy (dNTP). Při Sangerově sekvenování se replikace DNA provádí ve čtyřech samostatných zkumavkách spolu se čtyřmi typy ddNTP odděleně. Deoxynukleotidy nejsou zcela nahrazeny příslušnými ddNTP. Směs konkrétního dNTP (například; dATP + ddATP) je zahrnuta do zkumavky a replikována. Čtyři oddělené produkty ve zkumavkách se nanesou na gel ve čtyřech samostatných jamkách. Poté přečtením gelu lze sestavit sekvenci, jak je znázorněno na obrázku 02.
Obrázek 02: Sangerovo řazení
Sangerovo sekvenování je důležitou technikou, která pomáhá v mnoha oblastech molekulární biologie. Projekt lidského genomu byl úspěšně dokončen pomocí metod založených na Sangerově sekvenování. Sangerovo sekvenování je také užitečné při sekvenování cílové DNA, výzkumu rakoviny a genetických chorob, analýze genové exprese, identifikaci lidí, detekci patogenů, mikrobiálním sekvenování atd.
Sangerovo sekvenování má několik nevýhod:
- Délka sekvenované DNA nesmí být delší než 1000 párů bází
- Najednou lze sekvenovat pouze jeden řetězec.
- Proces je časově náročný a drahý.
Proto byly postupem času vyvinuty nové pokročilé sekvenační techniky k překonání těchto problémů. Sangerovo sekvenování se však stále používá díky svým vysoce přesným výsledkům až do délky fragmentů přibližně 850 párů bází.
Co je pyrosekvenování?
Pyrosekvenování je nová technika sekvenování DNA založená na „sekvenování syntézou“. Tato technika se opírá o detekci uvolňování pyrofosfátu po začlenění nukleotidu. Proces využívají čtyři různé enzymy: DNA polymer, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza a dva substráty adenosin 5' fosfosulfát (APS) a luciferin.
Proces začíná tím, že se primer naváže na templát jednovláknové DNA a DNA polymeráza zahájí začlenění nukleotidů, které jsou k němu komplementární. Když se nukleotidy spojí (polymerace nukleových kyselin), uvolní pyrofosfátové (dvě fosfátové skupiny svázané dohromady) a energie. Každé přidání nukleotidu uvolní ekvimolární množství pyrofosfátu. Pyrofosfát se přeměňuje na ATP pomocí ATP sulfurylázy v přítomnosti substrátu APS. Generovaný ATP řídí luciferázou zprostředkovanou konverzi luciferinu na oxyluciferin, čímž vzniká viditelné světlo v množství, které je úměrné množství ATP. Světlo je detekováno zařízením pro detekci fotonů nebo fotonásobičem a vytváří pyrogram. Apyráza degraduje ATP a neinkorporované dNTP v reakční směsi. Přidání dNTP se provádí jednou za čas. Protože přidání nukleotidu je známé podle začlenění a detekce světla, lze určit sekvenci templátu. Pyrogram se používá pro generování nukleotidové sekvence vzorku DNA, jak je znázorněno na obrázku 03.
Pyrosekvenování je velmi důležité při analýze polymorfismu jednoho nukleotidu a sekvenování krátkých úseků DNA. Vysoká přesnost, flexibilita, snadná automatizace a paralelní zpracování jsou výhody pyrosekvenování oproti Sangerovým sekvenačním technikám.
Obrázek 03: Pyrosekvenování
Jaký je rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním?
Sangerovo sekvenování vs pyrosekvenování |
|
| Sangerovo sekvenování je metoda sekvenování DNA založená na selektivním začlenění ddNTP pomocí DNA polymerázy a ukončení řetězce. | Pyrosequencing je metoda sekvenování DNA založená na detekci uvolňování pyrofosfátů po začlenění nukleotidu. |
| Použití ddNTP | |
| ddNTP se používají k ukončení replikace DNA | ddNTP se nepoužívají. |
| Zapojené enzymy | |
| Používá se DNA polymeráza. | Používají se čtyři enzymy: DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza. |
| Použité substráty | |
| APS a Luciferin se nepoužívají. | Používá se adenosin 5' fosfosulfát (APS) a luciferin. |
| Maximální teplota | |
| Toto je pomalý proces. | Toto je rychlý proces. |
Shrnutí – Sangerovo sekvenování vs pyrosekvenování
Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování jsou dvě metody sekvenování DNA používané v molekulární biologii. Sangerovo sekvenování vytváří pořadí nukleotidů v sekvenci ukončením prodlužování řetězce, zatímco pyrosekvenování vytváří přesné pořadí nukleotidů v sekvenci začleněním nukleotidů a detekcí uvolňování pyrofosfátů. Proto je hlavní rozdíl mezi Sangerovým sekvenováním a pyrosekvenováním v tom, že Sangerovo sekvenování funguje na sekvenování zakončením řetězce, zatímco pyrosekvenování funguje na sekvenování syntézou.
