Klíčový rozdíl – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidy jsou základní strukturální jednotky a stavební kameny DNA. Molekula DNA se skládá z polynukleotidového řetězce. V DNA se nacházejí čtyři různé nukleotidy. Tyto nukleotidy jsou složeny ze čtyř různých dusíkatých bází pojmenovaných A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Pořadí nukleotidů v molekule DNA má velký význam, protože kóduje důležitou genetickou informaci pro růst a vývoj organismů. Sekvenování DNA se týká procesu, který určuje přesnou nukleotidovou sekvenci DNA. Existují různé metody sekvenování DNA. Sekvenování Maxam Gilbert a Sangerovo sekvenování DNA jsou dvě metody sekvenování DNA, které patří k sekvenování první generace. Sekvenační postup Maxam Gilbert určuje sekvenci bází chemickým štěpením fragmentů DNA značených na 5' konci přednostně na každém ze čtyř nukleotidů a gelovou elektroforézou. Sangerova sekvenační procedura určuje nukleotidovou sekvenci syntetizací jednořetězcové DNA pomocí DNA polymerázy a dideoxynukleotidů a gelové elektroforézy. Toto je klíčový rozdíl mezi Maxamem Gilbertem a Sangerovým sekvenováním.
Co je sekvenování Maxama Gilberta?
Sekvenování Maxama Gilberta, také známé jako metoda chemického sekvenování, je technika, která byla vyvinuta k určení pořadí nukleotidů v DNA. Tuto metodu představili W alter Gilbert a Alan Maxam v roce 1976 a stala se populární, protože ji lze provádět přímo s purifikovanou DNA. Metoda Maxama Gilberta patří k první generaci sekvenování DNA a byla to první sekvenační metoda široce používaná vědci.
Základní princip této metody spočívá v restrikci koncově značených fragmentů DNA na specifických bázích pomocí chemikálií a podmínek specifických pro báze a separaci značených fragmentů elektroforézou, jak je znázorněno na obrázku 01. Fragmenty jsou separovány podle na jejich velikosti na gelu. Vzhledem k tomu, že fragmenty jsou označeny, lze snadno odvodit sekvenci molekuly DNA.
Maxamova Gilbertova metoda používá k rozbití DNA na specifických základech chemické látky specifické pro báze. K selektivnímu napadání purinů a pyrimidinů se používají dvě běžné chemikálie zvané dimethylsulfát a hydrazin.
Sekvenační metoda Maxam Gilbert se provádí v několika následujících krocích.
- Přečištění sekvence DNA pomocí restrikčních endonukleáz
- Značení konců fragmentů DNA přidáním radioaktivních fosfátů
- Přečištění značených fragmentů od neznačených fragmentů gelovou elektroforézou
- Separace DNA značené na konci do čtyř zkumavek a oddělené ošetření chemikáliemi specifickými pro báze
- Elektroforéza obsahu každé zkumavky na samostatných linkách na gelu a separace fragmentů podle jejich délky.
- Detekce fragmentů autoradiografem.
Obrázek 01: Maxam Gilbert Sequencing
Co je Sangerovo sekvenování?
Sangerovo sekvenování je sekvenační metoda vyvinutá Frederickem Sangerem a jeho kolegy v roce 1977 k určení sekvence bází daného fragmentu DNA. Je také známá jako sekvenování zakončení řetězce nebo metoda Dideoxy sekvenování. Tato metoda funguje na principu selektivního zabudování dideoxynukleotidů ukončujících řetězec (ddNTP), jako jsou ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocí DNA polymerázy během syntézy jednořetězcové DNA k ukončení tvorby řetězce. Dideoxynukleotidy postrádají 3'OH skupiny pro tvorbu fosfodiesterových vazeb se sousedním nukleotidem. Tvorba vlákna se tedy zastaví, jakmile je ddNTP začleněn do nově se tvořícího vlákna během Sangerova sekvenování.
V této metodě se provádějí čtyři samostatné reakce syntézy DNA (PCR) ve čtyřech samostatných zkumavkách s jedním typem ddNTP. Na zkumavky pro PCR jsou dodávány i další požadavky včetně primerů, dNTP, Taq polymerázy, specifických podmínek atd. Ve čtyřech zkumavkách se čtyřmi směsmi jsou provedeny čtyři samostatné reakce. Po PCR reakcích jsou výsledné fragmenty DNA tepelně denaturovány a separovány gelovou elektroforézou. Poté jsou fragmenty vizualizovány pomocí buď značeného (radioaktivního nebo fluorescenčního) primeru nebo dNTP, jak je znázorněno na obrázku 02.
Obrázek 02: Sangerova sekvence
Jaký je rozdíl mezi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Sekvenování Maxama Gilberta je první technika vyvinutá pro sekvenování DNA. | Sangerova sekvenační metoda byla zavedena po sekvenační metodě Maxama Gilberta. |
| Použití | |
| Tato metoda se používá zřídka. | Sangerovo sekvenování se běžně používá pro sekvenování. |
| Použití nebezpečných chemikálií | |
| Používá nebezpečné chemikálie. | Používání nebezpečných chemikálií je ve srovnání s metodou Maxama Gilberta omezené. |
| Označení pro detekci | |
| Tato metoda používá radioaktivní P32 pro značení konců fragmentů DNA. | Sangerovo sekvenování využívá radioaktivně nebo fluorescenčně značené ddNTP. |
Shrnutí – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Sekvenování Maxama Gilberta a Sangera jsou dva typy technik sekvenování DNA spadající pod první generaci sekvenování DNA. Sekvenování Maxama Gilberta je první metodou zavedenou pro sekvenování DNA v roce 1976 a provádí se rozbitím koncových fragmentů DNA pomocí chemikálií specifických pro bázi. Proto je známé jako chemické sekvenování. Sangerova metoda sekvenování byla představena v roce 1977 a je založena na ddNTP řízených řetězových terminačních reakcích. Sangerova metoda sekvenování je oblíbenější než metoda Maxam Gilbert kvůli několika nevýhodám metody Maxam Gilbert, jako je nadměrná spotřeba času, použití nebezpečných chemikálií atd. To je rozdíl mezi sekvenováním Maxama Gilberta a Sangera.
