Klíčový rozdíl mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním pomocí brokovnice spočívá v jejich metodě chování. Metoda klonování pomocí klonování zahrnuje mapování chromozomů a klonování před sekvenováním, zatímco klonování pomocí brokovnice vynechává během sekvenování jak mapování chromozomů, tak klonování.
Klonování pomocí klonování a klonování pomocí brokovnice jsou dvě metody moderního sekvenování genomu. Klonování klonováním je spolehlivější způsob sekvenování. Metoda klonování brokovnicovým sekvenováním je však rychlejší a levnější. Článek se zaměřuje na jemný rozdíl mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním pomocí brokovnice.
Co je to Clone by Clone Sequencing?
Klonování pomocí klonování je metoda sekvenování genomu. Vyžaduje mapování každého chromozomu před štěpením DNA. Po zmapování by měla být DNA rozložena na fragmenty dlouhé 150 kilobází. Tyto fragmenty jsou pak připraveny pro sekvenování. Dalším krokem je vložení fragmentů DNA do bakteriálních umělých chromozomů (BAC) a poté do bakteriálních buněk. Protože fragmenty jsou nyní uvnitř bakteriálních buněk, pokaždé, když se bakterie dělí, vložené fragmenty DNA se také dělí a vytvářejí mnoho identických kopií. Poté je DNA jednotlivého bakteriálního klonu fragmentována na fragmenty dlouhé 500 párů bází. Jsou to menší a překrývající se fragmenty. Dále probíhá sekvenování s vložením těchto fragmentů do vektoru se známou sekvencí DNA. Počínaje známou sekvencí vektoru pokračuje sekvenování až k neznámé sekvenci.
Po dokončení sekvenování je nutné identifikovat oblasti překrývajících se sekvencí. Poté dochází ke spojení fragmentů za vzniku větších fragmentů původně přítomných v BAC. Dále probíhá sestavení větších fragmentů do chromozomu podle mapy genomu.
Obrázek 01: Klonování pomocí klonování sekvenování
Významnou výhodou klonování pomocí sekvenování klonů je to, že předem připravená mapa genomu pomáhá spolehlivému sestavení větších fragmentů. Nevýhodou této metody sekvenování je však to, že generování map genomu a vytváření klonů je časově náročné. To však byla metoda preferovaná během ‚Projektu lidského genomu‘.
Co je Clone by Shotgun Sequencing?
Klonování pomocí brokovnice je sekvenační metoda, která náhodně rozděluje sekvence DNA na mnoho malých fragmentů a znovu sestavuje sekvenci pozorováním překrývajících se oblastí. Větší savčí genomy je obtížné klonovat a sestavit. Je to kvůli jejich konstrukční složitosti a velikosti. I když je metoda klonování klonováním spolehlivá, sekvenování genomů složitých organismů trvá dlouho. Proto se klonování pomocí brokovnice stalo spolehlivou levnější sekvenační metodou, kterou lze provádět rychleji. Moderní vědci se proto při řešení složitých genomů spoléhají na tuto metodu sekvenování.
Obrázek 02: Klonování pomocí sekvenování brokovnice
Během klonování metodou brokovnicového sekvenování neprobíhají žádné konvenční kroky mapování genomu a klonování. Zpočátku je celý genom fragmentován do různých velikostí od 20 kilobází do 300 kilobází. Dále se provádí sekvenování. Poté je nutné pomocí sofistikovaného počítačového softwaru sestavit fragmenty pohledem na překrývající se oblasti.
Klonování pomocí brokovnicového sekvenování pomáhá zlepšit přesnost existujících genomových sekvencí. Hlavní výhodou této metody je, že je mnohem rychlejší a levnější než metoda klonování pomocí klonování. Tento proces však nezahrnuje použití genetické mapy. Proto je pravděpodobnější, že během montáže dojde k chybám. To je tedy hlavní nevýhoda při klonování metodou sekvenování pomocí brokovnice.
Jaké jsou podobnosti mezi klonováním pomocí klonování sekvenováním a sekvenováním brokovnic?
- Jak klonování klonováním sekvenováním, tak sekvenování brokovnicí jsou dvě metody sekvenování genomu.
- Během obou sekvenačních technik probíhá sestavení rozložených fragmentů identifikací překrývajících se oblastí.
- Pro klonování i sekvenování pomocí brokovnice je také nezbytný rozklad DNA na menší fragmenty.
Jaký je rozdíl mezi klonováním pomocí klonování sekvenováním a sekvenováním brokovnic?
Technika sekvenování klonování klonem zahrnuje dva hlavní kroky: mapování chromozomů a klonování. Naproti tomu klonování pomocí brokovnice tyto dva kroky neprovádí; náhodně rozbije sekvence DNA na mnoho malých fragmentů a znovu sestaví sekvenci pozorováním překrývajících se oblastí. Toto je tedy klíčový rozdíl mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním pomocí brokovnice. Kvůli tomuto faktoru je sekvenování klonování klonem drahý a časově náročný proces, zatímco sekvenování klonováním brokovnicí je rychlejší a levnější.
Chyby během sestavování se však méně pravděpodobně vyskytnou během klonování pomocí sekvenování klonů. Díky tomu má vysokou spolehlivost. Klonování pomocí brokovnice je však poměrně méně spolehlivá technika. To je také významný rozdíl mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním pomocí brokovnice.
Níže uvedená infografika představuje více informací o rozdílu mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním brokovnic.
Shrnutí – klonování pomocí klonování sekvenování vs sekvenování brokovnic
Při shrnutí rozdílu mezi klonováním pomocí klonování sekvenováním a sekvenováním pomocí brokovnice jsou klonování pomocí klonování a sekvenování pomocí brokovnice dvě metody sekvenování genomu. Technika klonování pomocí klonování však zahrnuje jak mapování genomu, tak klonovací procesy, zatímco klonování pomocí brokovnice nikoli. Toto je klíčový rozdíl mezi klonováním pomocí klonování a sekvenováním pomocí brokovnice. Vzhledem k tomu, že mapování genomu probíhá během klonování sekvenováním klonů, je méně pravděpodobné, že dojde k chybám během sestavování sekvencí. Ale klonování pomocí brokovnice je mnohem rychlejší a levnější proces. Přesto je poměrně méně spolehlivý. Sekvenování klon po klonu bylo preferovanou metodou sekvenování během ‚Projektu lidského genomu‘. Moderní molekulární biolog se však více spoléhá na klonování pomocí brokovnicového sekvenování.
