Klíčový rozdíl – Chromozomální chůze vs skákání
Chromosom walking a chromozom jumping jsou dva technické nástroje používané v molekulární biologii pro lokalizaci genů na chromozomech a fyzické mapování genomů. Chromozomální chůze je technika používaná ke klonování cílového genu v genomové knihovně opakovanou izolací a klonováním sousedních klonů genomové knihovny. Chromozomální skákání je speciální verze chromozomální chůze, která překonává zlomové body chromozomální chůze. Chromozomální chůze může sekvenovat a mapovat pouze malé délky chromozomů, zatímco chromozomální skákání umožňuje sekvenování velkých částí chromozomů. Toto je klíčový rozdíl mezi chromozomální chůzí a chromozomálním skákáním.
Co je to chromozomální chůze?
Chromosome walking je nástroj, který zkoumá neznámé oblasti sekvence chromozomů pomocí překrývajících se restrikčních fragmentů. Při chůzi chromozomů je část známého genu použita jako sonda a pokračuje charakterizací celé délky chromozomu, který má být mapován nebo sekvenován. To jde od značky k cílové délce. Při chůzi chromozomů se konce každého překrývajícího se fragmentu používají k hybridizaci k identifikaci další sekvence.
Sondy jsou připraveny z koncových částí klonované DNA a jsou subklonovány. Poté jsou použity k nalezení dalšího překrývajícího se fragmentu. Všechny tyto překrývající se sekvence se používají ke konstrukci genetické mapy chromozomu a lokalizaci cílových genů. Je to metoda analýzy dlouhých úseků DNA pomocí malých překrývajících se fragmentů z rekonstruované genomové knihovny.
Technika chromozomové chůze – kroky
-
Izolace fragmentu DNA, který obsahuje známý gen nebo marker blízko cílového genu
- Příprava restrikční mapy vybraného fragmentu a subklonování koncové oblasti fragmentu pro použití jako sonda
- Hybridizace sondy s dalším překrývajícím se fragmentem
- Příprava restrikční mapy fragmentu 1 a subklonování koncové oblasti fragmentu 1 pro použití jako sondy pro identifikaci dalšího překrývajícího se fragmentu.
- Hybridizace sondy s dalším překrývajícím se fragmentem 2
- Příprava restrikční mapy fragmentu 2 a subklonování koncové oblasti fragmentu 2, aby sloužila jako sonda pro identifikaci dalšího překrývajícího se fragmentu
Výše uvedené kroky by měly pokračovat až do cílového genu nebo do 3' konce celkové délky sekvence.
Obrázek 01: Technika chromozomové chůze
Chromosom walking je důležitým aspektem cytogenetiky při hledání SNP mnoha organismů a analýze geneticky přenosných chorob a hledání mutací příslušných genů.
Co je přeskakování chromozomů?
Chromosomal jumping je technika používaná v molekulární biologii pro fyzikální mapování genomů organismů. Tato technika byla zavedena k překonání bariéry chromozomální chůze, která vznikla při nalezení repetitivních oblastí DNA během procesu klonování. Techniku skákání chromozomů lze proto považovat za speciální verzi chromozomální chůze. Jde o rychlou metodu ve srovnání s chromozomální chůzí a umožňuje obejít opakující se sekvence DNA, které nejsou náchylné ke klonování během chromozomální chůze. Chromozomální přeskakování zužuje propast mezi cílovým genem a dostupnými známými markery pro mapování genomu.
Nástroj pro skákání chromozomů začíná řezáním specifické DNA speciálními restrikčními endonukleázami a ligací fragmentů do kruhových smyček. Pak se k sekvenování cirkularizovaných smyček použije primer navržený ze známé sekvence. Tento primer umožňuje skákání a sekvenování alternativním způsobem. Může tedy obejít opakující se sekvence DNA a rychle procházet chromozomem za účelem hledání cílového genu.
Objev genu kódujícího onemocnění cystickou fibrózou byl proveden pomocí nástroje chromozomálního přeskakování. V kombinaci mohou chromozomální skákání a chůze zlepšit proces mapování genomu.
Obrázek 02: Přeskakování chromozomů
Jaký je rozdíl mezi chromozomální chůzí a skákáním?
Chromozomová chůze vs skákání |
|
| Chromozom je nástroj používaný v molekulární biologii pro mapování genomu a lokalizaci specifických genů. | Chromosom jumping je nástroj používaný pro fyzické mapování genomů a rychlé nalezení cílových genů v chromozomech. |
| Srovnávací délky sekvenování | |
| Chromozomální chůzí lze klonovat pouze malé fragmenty. | Větší délky chromozomů lze mapovat chromozomálním přeskakováním. |
| Klonování repetitivní DNA v chromozomech | |
| Technika chromozomové chůze má potíže s procházením opakujících se sekvencí DNA nalezených v chromozomech. | Umožňuje obejít opakující se sekvence DNA. Proto není problém je najít během sekvenování. |
| Faktory ovlivňující procesy | |
| Úspěch procesu závisí na velikosti genomu a vzdálenosti, kterou je třeba „ujít“od známé genomové pozice směrem k požadovanému genu. | Úspěch nezávisí na velikosti genomu vzdálenosti od markeru k cíli. |
| Účinky neklonované DNA | |
| Chromozomální chůzi lze zastavit neklonovanými fragmenty DNA. | Nejnižší notové pikoly, které mohou hrát, je D4. |
| Potřeba známé sekvence | |
| Proces začíná známým genem poblíž cíle. | Proces vyžaduje známý fragment pro návrh primeru. |
Shrnutí – Chromozomální chůze vs skákání
Chromozomální chůze se často používá, když je známo, že konkrétní gen se nachází v blízkosti dříve klonovaného genu v chromozomu a je možné jej identifikovat opakovanou izolací sousedních genomových klonů z genomové knihovny. Pokud jsou však během techniky chromozomální chůze nalezeny opakující se oblasti DNA, proces nemůže pokračovat. Technika se tedy od tohoto bodu rozpadá. Chromozomální skok je molekulárně biologický nástroj, který překonává toto omezení pro mapování genomů. Obchází tyto opakující se oblasti DNA, které je obtížné klonovat, a pomáhá při fyzickém mapování genomů. Toto je hlavní rozdíl mezi chromozomální chůzí a skákáním.
