Klíčový rozdíl – PCR vs sekvenování DNA
PCR a sekvenování DNA jsou dvě důležité techniky v molekulární biologii. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je proces, který vytváří velké množství kopií fragmentu DNA. Sekvenování DNA je technika, jejímž výsledkem je přesné pořadí nukleotidů daného fragmentu DNA. Toto je klíčový rozdíl mezi PCR a sekvenováním DNA. PCR je jedním z hlavních kroků zahrnutých v sekvenování DNA.
Co je to PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika amplifikace DNA používaná v molekulární biologii. Vytváří tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA. Tuto metodu vyvinul Kary Mullis v roce 1983. V této technice slouží fragment DNA, který má být amplifikován, jako templát a enzym DNA polymeráza přidává komplementární nukleotidy k primeru, který je dostupný v PCR směsi. Na konci PCR reakce se syntetizuje mnoho kopií DNA vzorku.
Směs PCR obsahuje různé složky, včetně DNA, DNA polymerázy (Taq polymeráza), primerů (přímé a reverzní primery), nukleotidů (stavební bloky DNA) a pufru. PCR probíhá uvnitř stroje PCR a do stroje by měla být vložena správná směs PCR a měl by být spuštěn správný program. Tato technika umožňuje produkci tisíců až milionů kopií určité části DNA z velmi malého množství DNA.
Reakce PCR probíhají cyklickým způsobem a vytvářejí viditelné množství produktů PCR na gelu. PCR reakce zahrnuje tři hlavní kroky, a to denaturaci, nasedání primerů a prodlužování řetězce, jak je znázorněno na obrázku 01. Tyto tři kroky probíhají při třech různých teplotách. DNA existuje ve dvouvláknové formě vodíkovými vazbami mezi komplementárními bázemi. Před implikací by měla být dvouřetězcová DNA od sebe oddělena. Provádí se tím, že se dává vysoká teplota. Při vysoké teplotě se dvouvláknová DNA denaturuje na jednovláknová. Pak by se primery měly přiblížit k přilehlým koncům specifického fragmentu nebo genu DNA. Primer je krátký kousek jednovláknové DNA, který je komplementární k cílové sekvenci. Přímé a reverzní primery nasedají s komplementárními bázemi na lemujících koncích denaturovaného vzorku DNA při teplotě nasedání. Základní nátěry by měly být tepelně odolné. Jakmile primery nasednou se vzorkem DNA, enzym taq polymeráza zahájí syntézu nových vláken přidáním nukleotidů, které jsou komplementární k cílové DNA. Taq polymeráza je tepelně stabilní enzym izolovaný z termofilní bakterie zvané Thermus aquaticus. PCR pufr udržuje optimální podmínky pro působení taq polymerázy. Tyto tři stupně PCR reakcí se opakují, aby se vytvořilo požadované množství produktu PCR. Po každé PCR reakci se počet kopií DNA zdvojnásobí. V PCR lze tedy pozorovat exponenciální amplifikace. Produkty PCR lze pozorovat pomocí gelové elektroforézy a lze je purifikovat pro další studie.
Obrázek 01: Hlavní kroky PCR reakce
PCR je cenným nástrojem v lékařském a biologickém výzkumu. PCR má zvláštní hodnotu ve forenzní vědě, protože může amplifikovat DNA pro studie z malých vzorků od zločinců a vytvářet forenzní profily DNA. PCR je široce používána v mnoha oblastech molekulární biologie včetně genotypizace, klonování genů, detekce mutací, sekvenování DNA, mikročipů DNA a testování otcovství atd.
Obrázek 02: Polymerázová řetězová reakce
Co je sekvenování DNA?
Sekvenování DNA je stanovení přesného pořadí nukleotidů – adeninu, guaninu, cytosinu a thyminu v daném fragmentu DNA. Genetická informace je uložena v sekvencích DNA pomocí správného pořadí nukleotidů. Nalezení přesného pořadí nukleotidů ve fragmentu DNA je proto velmi důležité vědět o struktuře a funkci genů.
Sekvenační protokol DNA zahrnuje různé procesy. Prvním krokem je izolace zainteresované DNA nebo genomové DNA organismu. Pomocí PCR (jak je popsáno výše) by měla být amplifikována požadovaná oblast DNA. Amplifikovaný produkt PCR by měl být separován gelovou elektroforézou a purifikován. Amplifikované fragmenty slouží jako templáty pro sekvenování. Sekvenování může být provedeno buď podle Sangerova sekvenování nebo vysoce výkonné sekvenační metody. Sangerovo sekvenování vyžaduje kapilární elektroforézu výsledných fragmentů DNA. Určení správného pořadí nukleotidů lze provést ručním čtením autoradiografů nebo pomocí automatických sekvenátorů DNA.
Sekvenování genů přispělo k projektu Human genome a usnadnilo mapování lidského genomu v roce 2003. Ve forenzní technice umožnilo sekvenování DNA identifikaci jedinců, kteří vykazují jedinečné sekvence DNA, a identifikovali zločince. V medicíně lze sekvenování DNA použít k detekci genů odpovědných za genetická a jiná onemocnění, nalezení defektních genů a jejich nahrazení správnými geny. V zemědělství se informace o sekvenování DNA některých mikroorganismů používají k produkci transgenních plodin s ekonomicky žádoucími vlastnostmi.
Obrázek 03: Sekvenování DNA
Jaký je rozdíl mezi PCR a sekvenováním DNA?
PCR vs sekvenování DNA |
|
| Proces PCR vytváří tisíce až miliony kopií zainteresovaného fragmentu DNA. | Sekvenování DNA je proces stanovení přesného pořadí nukleotidů v daném fragmentu DNA. |
| Výsledek | |
| PCR vytváří tisíce až miliony kopií konkrétního fragmentu DNA | Výsledkem je správné pořadí bází v konkrétním fragmentu DNA. |
| Zapojení ddNTPs | |
| PCR nevyžaduje ddNTP. Používá dNTPs. | Sekvenování DNA vyžaduje ddNTP k ukončení tvorby řetězce. |
Shrnutí – PCR vs sekvenování DNA
PCR a sekvenování DNA jsou velmi důležité nástroje v mnoha oblastech molekulární biologie. Amplifikace fragmentů DNA se provádí technikou PCR, přičemž správné pořadí nukleotidů fragmentu DNA je určeno sekvenováním DNA. Toto je rozdíl mezi PCR a sekvenováním DNA.
