Klíčový rozdíl – PCR vs replikace DNA
Replikace DNA je přirozený proces, který se vyskytuje v živých organismech. Zahrnuje produkci dvou identických kopií jedné molekuly DNA. Replikace DNA je extrémně důležitý proces biologické dědičnosti. Genetická informace se přenáší z rodiče na potomka především díky schopnosti replikace DNA. Jde tedy o základní proces, který se vyskytuje téměř ve všech živých organismech. Tento proces probíhá in vivo. Replikace DNA však může být provedena také metodami in vitro. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je jednou takovou in vitro metodou replikace DNA. PCR je metoda amplifikace DNA prováděná v laboratořích. Produkuje tisíce až miliony kopií DNA ze zainteresovaného fragmentu DNA nebo genu. Existují rozdíly mezi in vivo replikací DNA a PCR. Klíčový rozdíl mezi těmito dvěma je v tom, že PCR se provádí v PCR stroji při udržovaných teplotách, aby se vytvořilo velké množství kopií DNA, zatímco replikace DNA nastává uvnitř těla při tělesné teplotě za vzniku dvou identických kopií jedné molekuly DNA.
Co je to PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika amplifikace DNA in vitro, která se běžně provádí v molekulárně biologických laboratořích. Tato metoda umožnila produkci tisíců až milionů kopií zvláště zajímavého fragmentu DNA. PCR zavedl Kary Mullis v roce 1980. V této technice slouží zainteresovaný fragment DNA jako templát pro vytváření kopií. Jako enzym DNA polymerázy se používá enzym zvaný Taq polymeráza, který bude katalyzovat syntézu nových vláken fragmentu DNA. Primery, které jsou ve směsi PCR, budou fungovat jako výchozí body pro extenze fragmentů. Na konci PCR reakce lze získat mnoho kopií vzorku DNA.
Všechny přísady, které jsou nezbytné k vytvoření kopií DNA, jsou součástí směsi PCR. Jsou to vzorková DNA, DNA polymeráza (Taq polymeráza), primery (přímé a reverzní primery), nukleotidy (stavební bloky DNA) a pufr. PCR reakce probíhá v PCR stroji a měla by být napájena správnou PCR směsí a správným PCR programem. Pokud jsou reakční směs a program správné, vytvoří požadované množství kopií určité části DNA z velmi malého množství DNA.
Reakce PCR zahrnuje tři hlavní kroky, a to denaturaci, nasedání primerů a prodlužování řetězce. Tyto tři kroky probíhají při třech různých teplotách. DNA existuje jako dvouvláknová šroubovice. Dvě vlákna jsou spojena vodíkovými můstky. Před amplifikací se dvouřetězcová DNA oddělí působením vysoké teploty. Při vysoké teplotě se dvouvláknová DNA denaturovala na jednovláknová. Potom primery nasedají s lemujícími konci zainteresovaného fragmentu nebo genu DNA. Primer je krátký kousek jednovláknové DNA, který je komplementární ke koncům cílové sekvence. Přímé a reverzní primery nasedají s komplementárními bázemi na přilehlých koncích denaturovaného vzorku DNA při teplotě nasedání.
Když jsou primery spojeny s DNA, enzym Taq polymeráza zahájí syntézu nových vláken přidáním nukleotidů, které jsou komplementární k templátové DNA. Taq polymeráza je tepelně stabilní enzym, který je izolován z termofilní bakterie zvané Thermus aquaticus. PCR pufr udržuje optimální podmínky pro působení Taq polymerázy. Tyto tři stupně PCR reakce se opakují, aby se vytvořilo požadované množství produktu PCR. Při každé PCR reakci se počet kopií DNA zdvojnásobuje. V PCR lze tedy pozorovat exponenciální amplifikace. Produkt PCR lze pozorovat pomocí gelové elektroforézy, protože produkuje viditelné množství DNA na gelu a lze jej purifikovat pro další studie, jako je sekvenování atd.
Obrázek 01: PCR
PCR je cenným nástrojem v lékařském a biologickém výzkumu. Zejména ve forenzních studiích má PCR nesmírnou hodnotu, protože může amplifikovat DNA pro studie z malých vzorků zločinců a vytvářet forenzní profily DNA. PCR je široce používána v mnoha oblastech molekulární biologie včetně genotypizace, klonování genů, detekce mutací, sekvenování DNA, mikročipů DNA a testování otcovství atd.
Co je replikace DNA?
Replikace DNA je proces, který vytváří dvě identické kopie DNA z jedné molekuly DNA. Je to důležitý proces biologické dědičnosti. K replikaci DNA dochází ve všech živých organismech. Genom rodičovské buňky by měl být replikován, aby se genom předal dceřiné buňce. Proces replikace DNA má tři hlavní kroky nazývané iniciace, prodloužení a ukončení. Tyto kroky jsou katalyzovány různými enzymy. Replikace DNA začíná v místě zvaném počátek replikace v genomu buněk. V genomu existuje DNA ve dvouvláknové formě. Tyto dva řetězce jsou odděleny na začátku replikace DNA, a to pomocí ATP dependentní DNA helikázy. Odvíjení DNA je hlavní událostí, ke které dochází v iniciačním kroku. Použitím oddělených řetězců DNA jako templátů syntetizuje DNA polymeráza nová komplementární vlákna templátových řetězců ve směru 5' až 3'. Toto je krok zvaný prodlužování. K ukončení dojde, když se dvě replikační vidlice setkají na opačném konci rodičovského chromozomu.
Obrázek 02: Replikace DNA
Kromě DNA polymerázy se replikace DNA účastní několik enzymů, jako je DNA primáza, DNA helikáza, DNA ligáza a topoizomeráza. Zvláštním rysem replikace DNA in vivo je to, že produkuje fragmenty Okazaki. Jeden pramen se nepřetržitě formuje, zatímco druhý se tvoří v malých kouscích.
Jaké jsou podobnosti mezi PCR a replikací DNA?
- Při PCR i DNA replikaci je dvouřetězcová DNA od sebe oddělena.
- V procesech PCR i replikace DNA se DNA kopíruje.
- Procesy PCR i replikace DNA jsou opravdu důležité.
- V procesech PCR i replikace DNA se účastní enzym DNA polymeráza.
Jaký je rozdíl mezi PCR a replikací DNA?
PCR vs replikace DNA |
|
| PCR je in vitro metoda amplifikace DNA, při které se produkují tisíce až miliony kopií DNA. | Replikace DNA je přirozený proces, který vytváří dvě identické kopie DNA z jedné molekuly DNA. |
| Kroky | |
| PCR má tři kroky; denaturace, nasedání primeru a prodloužení řetězce. | Replikace DNA má tři kroky; iniciace, prodloužení a ukončení. |
| Zapojení primerů | |
| PCR potřebuje umělé primery. | Replikace DNA nepotřebuje umělé primery. Krátký fragment RNA se účastní replikace DNA. |
| Denaturace dvoupramenných vláken | |
| Dvojí vlákna se oddělují aplikací vysoké teploty v PCR. | Dvojí vlákna jsou od sebe oddělena enzymem DNA helikáza při replikaci DNA. |
| Zapojený enzym | |
| PCR používá Taq polymerázu. | Replikace DNA využívá DNA polymerázu. |
| Teplota | |
| PCR probíhá při třech různých teplotách uvnitř stroje. | K replikaci DNA dochází při tělesné teplotě v těle živého organismu. |
| In vivo nebo in vitro | |
| PCR je metoda in vitro. | Replikace DNA je metoda in vivo. |
Shrnutí – PCR vs replikace DNA
Replikace DNA je proces výroby dvou identických kopií DNA z jedné molekuly DNA. Vyskytuje se ve všech živých organismech, protože nabízí způsob předání genetické informace z rodiče na potomstvo. Skládá se ze tří enzymaticky katalyzovaných kroků, jmenovitě iniciace, elongace a ukončení. Replikace DNA může být provedena uměle v laboratoři. PCR je jedním ze způsobů produkce velkého počtu kopií DNA ze zainteresované DNA. PCR se běžně provádí v molekulárně biologických laboratořích, protože jde o snadný způsob výroby kopií DNA. Toto je rozdíl mezi PCR a replikací DNA.
