Klíčový rozdíl – papírová versus tenkovrstvá versus sloupcová chromatografie
Papírová chromatografie, chromatografie na tenké vrstvě a sloupcová chromatografie jsou tři typy chromatografických technik. Klíčový rozdíl mezi papírovou chromatografií, chromatografií na tenké vrstvě a sloupcovou chromatografií je založen na typu stacionární fáze použité v chromatografické technice. Papírová chromatografie používá celulózový papír jako svou stacionární fázi, chromatografie na tenké vrstvě používá jako stacionární fázi oxid hlinitý nebo silikagel, zatímco sloupcová chromatografie používá jako stacionární fázi kolonu naplněnou vhodným materiálem matrice.
V procesu separace a identifikace biomolekul, jako jsou proteiny a sacharidy, je chromatografie důležitou biofyzikální technikou. Chromatografie odděluje sloučeniny na základě jejich rozpustnosti, velikosti a náboje. Chromatografie založená na separačním mechanismu využívá mechanismy, jako je iontová výměna, absorpce, dělení a vylučování velikosti a existují tři chromatografické techniky; jmenovitě papírová, tenkovrstvá a kolonová chromatografie. Papírová chromatografie je založena na adsorpci pevná látka-kapalina a rozpustnosti sloučeniny a jako stacionární fáze používá celulózový papír. Chromatografie na tenké vrstvě je založena na adsorpci molekul pevná látka-kapalina. Má stacionární fázi, která je obvykle vyrobena z oxidu hlinitého nebo silikagelu, a mobilní fázi, která je rozpouštědlem. Sloupcová chromatografie využívá kolonu naplněnou matricí, která se používá k separaci molekul především na základě jejich velikosti, afinity nebo jejího náboje.
Co je to papírová chromatografie?
Papírová chromatografie je nejjednodušší typ používané chromatografie a nepoužívá se pro rozsáhlý výzkum. Používá se hlavně ve studentských laboratořích k identifikaci biomolekul, jako jsou aminokyseliny a sacharidy přítomné ve směsích. Papírová chromatografie používá stacionární fázi, která se vyrábí pomocí celulózového papíru nebo filtračního papíru Whatman, a mobilní fázi, která se obvykle připravuje pomocí organických rozpouštědel, jako je n-butanol atd. Stacionární fáze je nasycena vodou, čímž se stacionární fáze stává kapalnou. Když se tedy sloučeniny nanesou na skvrny a nechají se běžet v přítomnosti mobilní fáze, v závislosti na rozpustnosti sloučenin se oddělí. Po vytvoření chromatogramu lze tedy provést barvení, aby se určila délka každé sloučeniny. Tím lze vypočítat retenční faktor.
Obrázek 01: Papírová chromatografie
Papírová chromatografie může být dále klasifikována jako vzestupná papírová chromatografie a sestupná papírová chromatografie v závislosti na směru proudícího rozpouštědla.
Co je tenkovrstvá chromatografie?
Chromatografie na tenké vrstvě neboli TLC je běžně používaná technika k identifikaci různých aminokyselin přítomných ve směsi nebo k identifikaci proteinů. Technika separace je založena na adsorpci pevná látka-kapalina. Při chromatografii na tenké vrstvě se jako stacionární fáze používá deska z oxidu hlinitého nebo silikagelu. Směs rozpouštědel se mění podle požadavku a může používat různé kombinace organických sloučenin, jako je n-butanol, kyselina octová a voda k přípravě rozpouštědla. Sloučeniny, které se mají oddělit, se nanesou na desku a ponoří se do směsi rozpouštědel. Jakmile se rozpouštědlo pohybuje nahoru na základě kapilárního účinku dané destičkou, pohybují se i sloučeniny nanesené na destičce v závislosti na jejich rozpustnosti v rozpouštědle.
Obrázek 02: Chromatografie na tenké vrstvě
Detekce skvrn po chromatogramu se provádí různými postupy barvení. Někteří používají barvení ninhydrinem, což je docela toxická metoda barvení. Moderní tenkovrstvé chromatogramy používají fluorescenční techniky k prohlížení chromatogramu po běhu. V závislosti na vzdálenosti, kterou urazil, lze vypočítat retenční čas každé sloučeniny. To lze použít k identifikaci typu separované sloučeniny na základě použité směsi. TLC se používá hlavně k identifikaci aminokyselin v proteinové směsi a také k oddělení různých typů monosacharidů přítomných ve směsi.
Co je sloupcová chromatografie?
Sloupcová chromatografie je široký pojem používaný k popisu mnoha typů chromatografických technik, které používají separační metodu založenou na koloně. Při sloupcové chromatografii se k oddělení sloučenin používá fyzikální kolona s náplní. Separace může být založena na různých fyzikálních vlastnostech sloučenin. Těmito vlastnostmi mohou být náboj, velikost, 3D konformace a vazebná kapacita atd. Kolona naplněná matricovým materiálem tedy působí jako stacionární fáze a promývací pufr aplikovaný na kolonu působí jako mobilní fáze.
Pokud jsou molekuly odděleny na základě velikosti, je obalový materiál zabalen tak, že zanechává póry, kterými mohou sloučeniny procházet. Větší molekuly, které nemohou protékat póry, jsou tedy eluovány jako první, zatímco menším molekulám trvá eluce mnohem déle.
Obrázek 03: Sloupcová chromatografie
Pokud jsou molekuly odděleny na základě jejich náboje, bude stacionární fáze obsahovat buď aniontový nebo kationtoměnič, ke kterému budou sloučeniny přitahovány na základě svého náboje. Během promývacího kroku budou tedy nenavázané sloučeniny eluovány. Po přidání elučního pufru budou navázané nabité sloučeniny eluovány. Detekce těchto eluentů je většinou založena na spektrofotometrických technikách.
Jaké jsou podobnosti mezi papírovou tenkovrstvou a sloupcovou chromatografií?
- Všechny tři techniky papírové tenkovrstvé a kolonové chromatografie se používají pro separaci biomolekul, jako jsou aminokyseliny, proteiny a sacharidy.
- Techniky papírové tenkovrstvé a kolonové chromatografie mají mobilní fázi a stacionární fázi.
- Techniky papírové tenkovrstvé a kolonové chromatografie využívají k separaci biofyzikální mechanismy.
Jaký je rozdíl mezi tenkovrstvou papírovou a kolonovou chromatografií?
Papír vs tenkovrstvá vs sloupcová chromatografie |
|
| Papírová chromatografie | Papírová chromatografie je chromatografická technika používaná k separaci sloučenin na základě adsorpce kapalina-kapalina a rozpustnosti sloučeniny. Jako svou stacionární fázi používá celulózový papír. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | Chromatografie na tenké vrstvě je další chromatografická technika založená na adsorpci molekul pevná látka-kapalina. Má stacionární fázi vyrobenou z oxidu hlinitého nebo silikagelu a rozpouštědlo jako mobilní fázi, kterým je rozpouštědlo. |
| Sloupcová chromatografie | Sloupcová chromatografie využívá kolonu naplněnou matricí, která se používá k separaci molekul především na základě jejich velikosti, afinity nebo jejího náboje. |
| Stacionární fáze | |
| Papírová chromatografie | Papír vyrobený z nitrocelulózy Whatman se používá jako stacionární fáze v papírové chromatografii. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | Alumina nebo silikagel se používá jako stacionární fáze tenkovrstvé chromatografie. |
| Sloupcová chromatografie | Jako stacionární fáze v kolonové chromatografii se používá kolona naplněná vhodnou náplňovou látkou. |
| Mobilní fáze | |
| Papírová chromatografie | Probíhající rozpouštědlo je mobilní fází papírové chromatografie. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | Probíhající rozpouštědlo je mobilní fáze chromatografie na tenké vrstvě. |
| Sloupcová chromatografie | Promývací pufr je mobilní fáze kolonové chromatografie. |
| Mechanismy použité pro oddělení | |
| Papírová chromatografie | Papírová chromatografie je založena na absorpci pevná látka-kapalina. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | chromatografie na tenké vrstvě je založena na absorpci pevná látka-kapalina. |
| Sloupcová chromatografie | Sloupcová chromatografie je založena na vyloučení velikosti, náboje a tvaru. |
| Elution Buffer | |
| Papírová chromatografie | Nevyžaduje se papírovou chromatografií. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | Není vyžadováno pro chromatografii na tenké vrstvě. |
| Sloupcová chromatografie | Požadováno při sloupcové chromatografii. |
| Detekce | |
| Papírová chromatografie | Obarvení a stanovením retenčního faktoru. |
| Chromatografie na tenké vrstvě | Obarvení a stanovením retenčního faktoru. |
| Sloupcová chromatografie | Spektrofotometrické stanovení. |
Shrnutí – tenkovrstvá papírová vs sloupcová chromatografie
Papírová chromatografie, TLC a sloupcová chromatografie jsou separační techniky používané k separaci biomolekul, jako jsou proteiny, aminokyseliny a sacharidy (hlavně monosacharidy). Papírová chromatografie používá jako stacionární fázi celulózový papír a mechanismus separace je založen na adsorpci pevná látka-kapalina. TLC také využívá mechanismy adsorpce pevná látka-kapalina. Molekuly jsou separovány na stacionární fázi v závislosti na jejich rozpustnosti v mobilní fázi. Sloupcová chromatografie využívá fyzikální vlastnosti, jako je velikost, tvar, náboj a molekulová hmotnost sloučeniny k separaci. Kolona naplněná matricovým materiálem působí jako stacionární fáze, zatímco promývací pufr působí jako fáze rozpouštědla. To je rozdíl mezi tenkovrstvým papírem a sloupcovou chromatografií.
