Klíčový rozdíl – Microarray vs RNA sekvenování
Transcriptom představuje celý obsah RNA přítomné v buňce včetně mRNA, rRNA, tRNA, degradované RNA a nedegradované RNA. Profilování transkriptomu je důležitý proces, abychom porozuměli náhledům na buňky. Existuje několik pokročilých metod profilování transkriptomu. Microarray a RNA sekvenování jsou dva typy technologií vyvinutých pro analýzu transkriptomu. Klíčový rozdíl mezi microarray a RNA sekvenováním je ten, že microarray je založen na hybridizačním potenciálu předem navržených značených sond s cílovými cDNA sekvencemi, zatímco RNA sekvenování je založeno na přímém sekvenování cDNA řetězců pomocí pokročilých sekvenačních technik, jako je NGS. Microarray se provádí s předchozí znalostí sekvencí a sekvenování RNA se provádí bez předchozí znalosti sekvencí.
Co je Microarray?
Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce výkonná metoda používaná vědci pro profilování transkriptomu. Je to nejoblíbenější přístup pro analýzu přepisů. Je to nízkonákladová metoda, která závisí na hybridizačních sondách.
Technika začíná extrakcí mRNA ze vzorku a konstrukcí cDNA knihovny z celkové RNA. Poté je smíchán s fluorescenčně značenými předem navrženými sondami na pevném povrchu (spot matrix). Komplementární sekvence hybridizují se značenými sondami v mikročipu. Poté se microarray promyje a prosévá a obraz se kvantifikuje. Shromážděná data by měla být analyzována, aby se získaly relativní profily výrazů.
Intenzita sond microarray se předpokládá úměrná množství transkriptů ve vzorku. Přesnost techniky však závisí na navržených sondách, předchozí znalosti sekvence a afinitě sond pro hybridizaci. Technologie microarray má proto omezení. Techniku microarray nelze provádět s transkripty s nízkou četností. Nedokáže rozlišit izoformy a identifikovat genetické varianty. Protože tato metoda závisí na hybridizaci sond, dochází v technice microarray k některým problémům souvisejícím s hybridizací, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace atd.
Obrázek 01: Microarray
Co je sekvenování RNA?
Sekvenování RNA brokovnicí (RNA seq) je nedávno vyvinutá technika sekvenování celého transkriptomu. Je to rychlá a vysoce výkonná metoda profilování transkriptomu. Přímo kvantifikuje expresi genů a vede k hlubokému zkoumání transkriptomu. RNA sekvence nezávisí na předem navržených sondách nebo předchozí znalosti sekvencí. Proto má metoda RNA seq vysokou citlivost a schopnost detekce nových genů a genetických variant.
Metoda sekvenování RNA se provádí v několika krocích. Celková RNA buňky musí být izolována a fragmentována. Poté je třeba připravit knihovnu cDNA pomocí reverzní transkriptázy. Každý cDNA řetězec musí být ligován s adaptéry. Poté musí být ligované fragmenty amplifikovány a purifikovány. Nakonec pomocí metody NGS musí být provedeno sekvenování cDNA.
Obrázek 02: Sekvenování RNA
Jaký je rozdíl mezi sekvenováním Microarray a RNA?
Microarray vs RNA sekvenování |
|
| Microarray je robustní, spolehlivá a vysoce výkonná metoda. | Sekvenování RNA je přesná a vysoce výkonná metoda. |
| Cost | |
| Toto je nízkonákladová metoda. | Toto je nákladná metoda. |
| Analýza velkého počtu vzorků | |
| To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků současně. | To usnadňuje analýzu velkého počtu vzorků. |
| Analýza dat | |
| Analýza dat je složitá. | Touto metodou se generuje více dat; proces je proto složitější. |
| Předchozí znalost sekvencí | |
| Tato metoda je založena na hybridizačních sondách, takže je nutná předchozí znalost sekvencí. | Tato metoda nezávisí na předchozí znalosti sekvence. |
| Strukturální variace a nové geny | |
| Tato metoda nedokáže detekovat strukturální variace a nové geny. | Tato metoda dokáže detekovat strukturální variace, jako je fúze genů, alternativní sestřih a nové geny. |
| Citlivost | |
| Toto nemůže detekovat rozdíly v expresi izoforem, takže to má omezenou citlivost. | Toto má vysokou citlivost. |
| Výsledek | |
| To může vést pouze k relativním úrovním vyjádření. To neposkytuje absolutní kvantifikaci genové exprese. | Poskytuje absolutní a relativní úrovně vyjádření. |
| Reanalýza dat | |
| Toto je potřeba znovu spustit, aby bylo možné znovu analyzovat. | Sekvenační data lze znovu analyzovat. |
| Potřeba konkrétního personálu a infrastruktury | |
| Pro microarray není potřeba konkrétní infrastruktura a personál. | Specifická infrastruktura a personál vyžadovaný sekvenováním RNA. |
| Technické problémy | |
| Technika Microarray má technické problémy, jako je křížová hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená rychlost detekce jednotlivých sond atd. | Technika RNA seq se vyhýbá technickým problémům, jako je zkřížená hybridizace, nespecifická hybridizace, omezená rychlost detekce jednotlivých sond atd. |
| Předsudky | |
| Toto je neobjektivní metoda, protože závisí na hybridizaci. | Bias je nízký ve srovnání s microarray. |
Shrnutí – Microarray vs RNA sekvenování
Metody Microarray a RNA sekvenování jsou vysoce výkonné platformy vyvinuté pro profilování transkriptomů. Obě metody poskytují výsledky, které vysoce korelují s profily genové exprese. Sekvenování RNA má však výhody oproti microarray pro analýzu genové exprese. Sekvenování RNA je citlivější metodou pro detekci transkriptů s nízkou četností než microarray. Sekvenování RNA také umožňuje diferenciaci mezi izoformami a identifikaci genových variant. Microarray je však běžnou volbou většiny výzkumníků, protože sekvenování RNA je nová a nákladná technika s problémy s ukládáním dat a komplexní analýzou dat.
