PCR vs Real-time PCR
PCR neboli polymerázová řetězová reakce je revolučním objevem v moderní molekulární biologii, který poprvé vyvinul chemik Kary Mullis v roce 1983. Umožňuje amplifikaci jediné sekvence v komplexní DNA pro analýzu. Základní myšlenkou PCR je, že dva primery, které jsou komplementární k opačným vláknům sekvence DNA, jsou orientovány proti sobě; primery produkují komplementární vlákna, z nichž každý obsahuje druhý primer. Výsledkem je tedy velké množství sekvence odpovídající DNA, která leží mezi dvěma primery. K prodloužení primerů v PCR se používá enzym DNA polymeráza. DNA polymeráza je termostabilní enzym a má schopnost přežít při vysokých teplotách (94 až 95 °C) používaných k denaturaci templátové DNA.
PCR zahrnuje tři kroky, jmenovitě opakovaná kola denaturace, nasedání primerů a syntézu DNA. K provedení této reakce se používá termocykler, takže může být naprogramován tak, aby rychle a přesně měnil teploty. Aplikace PCR jsou kriminální vyšetřování, otisk DNA, detekce patogenů a analýza DNA raných lidských druhů.
Co je konvenční PCR?
Existují tři hlavní fáze konvenční PCR, a to; Fáze amplifikace DNA, separace PCR a detekce produktů. Separace segmentů DNA se typicky provádí elektroforézou na agarózovém gelu. Produkty se poté barví etheiduim bromidem. Nakonec je detekce dosaženo vizualizací pásů na gelech pod UV světlem. Proto konečné výsledky konvenční PCR nejsou vyjádřeny jako čísla. Běžně je konvenční PCR schopna detekovat pouze jeden parametr.
Co je Real-time PCR?
Real-time PCR dokáže detekovat amplifikaci produktů, protože produkty jsou syntetizovány. S rozvojem technologie se PCR stala velmi oblíbenou technikou, zejména pro detekci a identifikaci bakterií v potravinách. PCR v reálném čase využívá systém fluorescenčního barviva a termocykler vybavený schopností fluorescenční detekce.
Jaký je rozdíl mezi konvenční PCR a real-time PCR?
• Konvenční PCR je časově náročnější, protože k analýze amplifikovaných produktů PCR používá gelovou elektroforézu. Naproti tomu PCR v reálném čase je méně časově náročná, protože dokáže detekovat amplifikace během raných fází reakce.
• PCR v reálném čase shromažďuje data ve fázi exponenciálního růstu PCR, zatímco tradiční PCR shromažďuje data na konci reakce.
• Výsledky konvenční PCR nemusí být příliš přesné, ale výsledky PCR v reálném čase jsou velmi přesné.
• PCR v reálném čase je citlivější než konvenční PCR.
• Konvenční PCR má velmi špatné rozlišení, zatímco PCR v reálném čase dokáže detekovat velmi malé změny díky vysokému rozlišení.
• Detekce koncového bodu konvenční PCR má krátký dynamický rozsah, zatímco detekce PCR v reálném čase má široký dynamický rozsah.
• Na rozdíl od konvenční PCR se v PCR v reálném čase nacházejí techniky automatické detekce.
• Konvenční PCR je vysoce sofistikovaná a náročná na práci více než PCR v reálném čase.
• Na rozdíl od real-time PCR nemůže konvenční PCR rozlišovat mezi mrtvými a živými bakteriemi.
• PCR v reálném čase používá fluorescenční systém barviv k detekci produktů, zatímco konvenční PCR používá ethidium bromid a UV světlo k vizualizaci pásů v médiu agarózového gelu.
