Klíčový rozdíl – klonování vs subklonování
Klonování a subklonování jsou molekulárně biologické postupy, které vytvářejí geneticky identické buňky nebo organismy nesoucí DNA nebo gen, které jsou předmětem zájmu. Klonování je technika, která zahrnuje inzerci zainteresovaného genu nebo DNA do vektoru, jeho replikaci v hostitelské bakterii a produkci buněk nebo organismů, které jsou přesnými kopiemi genetické výbavy. Subklonování je technika, která zahrnuje inzerci požadovaného genu, který je již vložen do vektoru, do sekundárního vektoru, jeho replikaci v hostitelské bakterii a produkci geneticky identických kopií buněk nebo organismů. Klíčový rozdíl mezi klonováním a subklonováním spočívá v tom, že při klonování se požadovaný gen, jakmile je ligován do vektoru, pokračuje v klonovacím procesu, zatímco při subklonování je již klonovaný požadovaný gen oddělen od rodičovského vektoru a znovu vložen do vektor příjemce a pokračujte v procesu.
Co je klonování?
Klonování je postup, který produkuje geneticky identické organismy nebo buňky. V přírodě se klonování děje způsobem nepohlavní reprodukce. Pokud nedochází k žádné genetické rekombinaci nebo změně, dceřiné buňky obdrží stejnou genetickou výbavu jako rodiče. Prokaryotické a eukaryotické organismy vytvářejí klony binárním štěpením, pučením, mitózou atd. V molekulární biologii je klonování genů nebo specifických fragmentů DNA oblíbenou metodou pro studium struktury a funkce daného úseku DNA.
Hlavním cílem molekulárního klonování je vytvořit miliony kopií geneticky identických buněk nebo organismů nesoucích požadovaný fragment DNA (hlavně geny). Vytváří organismy s přesnými genetickými kopiemi jiného. Primárně jsou specifické geny klonovány v molekulárních studiích pro získání strukturních a funkčních informací a pro sekvenování DNA. Klonování je také široce používáno pro produkci specifických proteinů nebo produktů ve velkém měřítku.
Postup klonování
Základní kroky postupu klonování jsou následující.
- Identifikace a izolace genu zájmu. (Amplifikace genu zájmu pomocí PCR).
- Restrikční štěpení genu zájmu (restrikční endonukleáza štěpí gen).
- Restrikční štěpení vektorové DNA. (Vektorová DNA je také štěpena stejnou restrikční endonukleázou).
- Vložení genu do vektoru a vytvoření rekombinantní molekuly.
- Transformace rekombinantního vektoru na hostitelskou bakterii.
- Izolace a identifikace transformovaných bakterií (plazmidový vektor by měl obsahovat selektovatelný gen, nejčastěji gen rezistence na antibiotika pro screening transformovaných bakterií).
- Rekombinantní genová exprese v hostiteli.
Obrázek_01: Postup klonování
Co je subklonování?
Subklonování je postup přesunutí požadovaného genu z jednoho vektoru do druhého, aby se viděla exprese genu, aby se získala požadovaná funkčnost genu. V této metodě jsou zahrnuty dva vektory; jmenovitě rodičovský vektor a cílový vektor. Klonované inserty se při subklonování opět přesunou do druhého vektoru. Cílem přenosu genu z prvního vektoru do druhého vektoru je získat něco, co by nemohlo být provedeno prvním vektorem, nebo znovu oddělit gen v již klonovaném fragmentu DNA a exprimovat jej samotný. Na začátku se v tomto postupu používají restrikční enzymy.
Postup subklonování
Základní kroky subklonování jsou následující.
- Pomocí restrikčních endonukleáz separace požadované DNA v donorovém plazmidu (rodičovský vektor).
- Amplifikace požadované DNA pomocí PCR.
- Přečištění produktu PCR (DNA zájmu) gelovou elektroforézou.
- Otevření recipientního plazmidu stejnými restrikčními endonukleázami použitými k separaci zájmové DNA v rodičovském plazmidu.
- Ligace požadované DNA (genu) do plazmidu příjemce za účelem vytvoření subklonovaného plazmidu.
- Transformace subklonovaného vektoru na kompetentní hostitelskou bakterii.
- Screening transformovaných buněk.
- Přečištění plazmidové DNA a použití pro sekvenování DNA nebo expresi genů k získání požadovaných produktů.
Subklonování se provádí v případech, kdy se izoluje jeden gen z klonované skupiny genů, nebo když je požadováno, aby se požadovaný gen přenesl do užitečného plazmidu, aby se zjistila přesná funkce požadovaného genu.
Obrázek_02: Postup subklonování
Jaký je rozdíl mezi klonováním a subklonováním?
Klonování vs subklonování |
|
| Klonování je postup, který produkuje geneticky identické organismy nebo buňky. | Subklonování je postup přesunutí požadovaného genu z jednoho vektoru do druhého, aby se viděla exprese genu, aby se získala požadovaná funkčnost genu. |
| Proces | |
| Oddělte požadovanou DNA z organismu a jednou vložte do vektoru a naklonujte | Již klonovaná DNA je oddělena od prvního vektoru a vložena do druhého vektoru a klonována. |
| Vložit pohyb pomocí vektorů | |
| Nepřesune inserty (DNA zájmu) z jednoho vektoru do druhého. | Přesuňte vložky z nadřazeného vektoru do cílového vektoru. |
Shrnutí – Klonování vs subklonování
Klonování vytváří geneticky identické buňky nebo organismy s vloženým genem nebo požadovanou DNA. Probíhá separací a inzercí požadované DNA do vektoru a expresí v hostitelské bakterii. Subklonování sdílí podobné kroky jako klonování. Při subklonování je však již klonovaný fragment DNA (zájmový gen) vložen do vektoru a transformován do hostitelské bakterie. To je klíčový rozdíl mezi klonováním a subklonováním.
