Klíčový rozdíl – nitrocelulóza vs PVDF
Western blotting je metoda, která umožňuje detekci a kvantifikaci specifických proteinů ze vzorku proteinu. Spolehlivost techniky závisí na výběru správné membrány pro absorpci proteinů z gelu. Existují různé typy mikroporézních membrán. Nitrocelulózové a PVDF membrány jsou dvě takové membrány, které výzkumníci upřednostňují kvůli jejich speciálním vlastnostem před ostatními typy membrán. Výběr mezi nitrocelulózou nebo PVDF je také další výzvou ve westernovém přenosu. Nitrocelulóza i PVDF mají vysokou absorpční kapacitu bílkovin. Klíčový rozdíl mezi nitrocelulózovou a PVDF membránou je v tom, že nitrocelulózové membrány nemají schopnost odstranit protilátky a znovu použít membránu pro opětovné zkoušení protilátek, zatímco PVDF membrány mají schopnost stripování a opětovného použití.
Co je nitrocelulóza?
Nitrocelulóza je polymer vyrobený ošetřením celulózy kyselinou dusičnou a používá se k výrobě mikroporézních membrán v molekulární biologii, zejména pro techniky blotování, jako je Southern, Northern a Western blot. Velikost pórů nitrocelulózových membrán se pohybuje od 3 do 20 um. Nitrocelulózové mikroporézní membrány usnadňují detekci imunochemické reakce probíhající na povrchu membrány. Proto se nitrocelulózové membrány často používají pro imobilizaci proteinů a detekci specifických proteinů ve western blotu. Nitrocelulózové membrány mohou také imobilizovat glykoproteiny a nukleové kyseliny.
Nitrocelulózové membrány jsou preferovány v testech s laterálním průtokem kvůli několika vlastnostem. Nitrocelulózové membrány absorbují proteiny ve vysoké koncentraci. Rozpouštědlo použité k zvlhčení membrány nesnižuje absorpci proteinu nitrocelulózové membrány. Nitrocelulózové membrány lze snadno řezat na požadovanou velikost gelu a přenášet proteiny z gelu na membránu elektrickým nebo kapilárním přenosem. Nitrocelulóza umožňuje rychlejší tok proteinů přes membránu s vysokým vazebným potenciálem. Nitrocelulóza vykazuje zlepšenou pevnost při manipulaci. Další speciální vlastností nitrocelulózové membrány je, že ji lze snadno nalepit nerozpouštědlovými voděodolnými lepidly na různé plastové podklady.
Obrázek 01: Nitrocelulózová membrána pro western blotting
Co je PVDF?
Polyvinylidendifluorid (PVDF) je fluoropolymer vyrobený polymerací vinylidendifluoridu a má vysokou imobilizační schopnost proteinů. Proto se mikroporézní membrány vyrobené z PVDF používají v technikách western blotting k analýze specifických proteinů ze směsí proteinů. PVDF membrány lze také použít pro analýzu aminokyselin a sekvenování proteinů. Nejdůležitější vlastností PVDF membrány nad nitrocelulózovou membránou je, že ji lze snadno odstranit z protilátek a znovu použít pro následné sondy protilátek.
PVDF membrány jsou silnější než nitrocelulózové membrány; jsou tedy odolnější vůči poškození při opětovném použití. PVDF membrány jsou vysoce hydrofobní. Proto musí být před použitím namočené v methanolu nebo isopropanolu.
Jaký je rozdíl mezi nitrocelulózou a PVDF?
Nitrocelulóza vs PVDF |
|
| Nitrocelulóza je polymer složený z celulózy. | PVDF je fluoropolymer vyrobený polymerací vinylidendifluoridu. |
| Velikost pórů membrány | |
| Typické velikosti pórů jsou 0,1, 0,2 nebo 0,45μ | Typické velikosti pórů jsou 0,1, 0,2 nebo 0,45μm |
| Kapacita vázání bílkovin | |
| Nitrocelulóza má schopnost vázat proteiny 80 až 100 μg/cm2. | PVDF má schopnost vázat proteiny 170 až 200 μg/cm2. |
| Citlivost | |
| Toto má nízkou citlivost ve srovnání s PVDF. | Toto má vysokou citlivost. |
| Detekce proteinů s nízkou expresí | |
| Vzhledem k tomu, že citlivost nitrocelulózových membrán je nízká, není vhodná pro detekci málo exprimovaných proteinů. | Je vhodnější pro detekci málo exprimovaných proteinů díky své vysoké citlivosti. |
| Hluk na pozadí | |
| Toto má nižší hluk na pozadí | Toto má vyšší šum na pozadí. |
| Interakce s proteiny | |
| Proteinové molekuly se vážou na nitrocelulózové membrány prostřednictvím hydrofobních interakcí. | Proteiny se vážou na PVDF membrány prostřednictvím hydrofobních a dipólových interakcí. |
| Povaha membrány | |
| Nitrocelulóza je křehká a křehká. Jsou však dostupné verze nitrocelulózy, které jsou odolné. | PVDF je odolnější a má vyšší chemickou odolnost. |
| Schopnost svléknout a znovu použít | |
| Nitrocelulóza může mít potíže se stripováním a opětovným zkoušením bez ztráty signálu. | PVDF je ideální pro aplikace resonding a sekvenování. |
| Vhodnost | |
| Nitrocelulóza je ideální pro detekci nízkomolekulárních proteinů. | PVDF je vhodnější pro detekci proteinů s vyšší molekulovou hmotností. |
| Další použití | |
| Nitrocelulóza může být použita pro analýzu nukleových kyselin a dot/slot blotting. | PVDF lze použít pro sekvenování proteinů a testovací systémy na pevné fázi. |
| Cena | |
| Toto je levnější než PVDF membrány. | Toto je dražší než nitrocelulózové membrány. |
| Potřeba předběžného zvlhčení | |
| Nitrocelulózové membrány nevyžadují předmáčení methanolem | PVDF membrány vyžadují předmáčení methanolem. |
Shrnutí – Nitrocelulóza vs PVDF
Nitrocelulózové membrány byly prvními komerčně používanými membránami pro stanovení laterálního průtoku. Mají vysokou schopnost absorbovat bílkoviny. Proto se při westernovém přenosu používají nitrocelulózové membrány. PVDF je další typ membrány používaný ve western blottingu a má také vysokou absorpční kapacitu proteinů. Oba typy se používají ve western blotu pro analýzu proteinů. PVDF membrány však mají více speciálních vlastností, díky čemuž jsou pro western blotting vhodnější než nitrocelulózové membrány. Nitrocelulózové membrány jsou však vhodnější pro detekci proteinů s nízkou molekulovou hmotností, membrány PVDF jsou vhodnější pro detekci proteinů s vysokou molekulovou hmotností. To je rozdíl mezi nitrocelulózovými a PVDF membránami.
