Klíčový rozdíl – Nick Translation vs. Primer Extension
Překlad přezdívky a prodloužení primeru jsou dvě důležité techniky používané v molekulární biologii. Klíčový rozdíl mezi translací nicku a prodloužením primeru je v tom, že proces translace nick produkuje značené sondy pro jiné hybridizační techniky, zatímco metoda prodloužení primeru identifikuje specifickou sekvenci RNA ze směsi a odhaluje informace o expresi mRNA. Obě techniky mají velký význam a běžně se provádějí v molekulárních výzkumných laboratořích.
Co je to Nick Translation?
Nick translace je důležitá technika používaná k přípravě značených sond pro různé molekulárně biologické techniky, jako je blotování, in situ hybridizace, fluorescenční in situ hybridizace atd. Jde o in vitro metodu značení DNA. DNA sondy se používají k identifikaci specifických sekvencí DNA nebo RNA. Pomocí značené sondy lze označit nebo zviditelnit specifické fragmenty z komplexní směsi nukleové kyseliny. Proto se značené sondy připravují za použití různých technik, které mají být použity pro různé techniky. Translace Nicka je jednou z takových metod, která produkuje značené sondy pomocí enzymů DNázy 1 a DNA polymerázy 1.
Proces translace nicku začíná aktivitou enzymu DNázy 1. DNáza 1 zavádí zářezy do fosfátové kostry dvouřetězcové DNA štěpením fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy. Jakmile je nick vytvořen, získá se volná 3'OH skupina nukleotidu a bude na ni působit enzym DNA polymeráza 1. 5' až 3' exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy z nicku směrem k 3' směru vlákna DNA. Současně funguje polymerázová aktivita enzymu DNA polymerázy 1 a přidává nukleotidy, které nahrazují odstraněné nukleotidy. Pokud byly nukleotidy označeny, dojde k nahrazení označenými nukleotidy a označí DNA pro identifikaci. Tato nově syntetizovaná značená DNA může být použita jako sondy v různých hybridizačních reakcích v molekulární biologii.
Obrázek 01: Proces překladu přezdívky
Co je Primer Extension?
Primer extension je technika, která se používá k nalezení specifické sekvence RNA ze směsi RNA a lokalizaci 5' konce mRNA transkriptu. Používá se také ke studiu struktury RNA a exprese. Metoda extenze primeru se provádí se značenými primery nebo se značenými nukleotidy. Pokud jsou použity značené primery, vylučuje to potřebu značení nukleotidů, které se používají pro syntézu cDNA. V této technice je několik kroků. Začíná extrakcí RNA ze vzorku. Poté se ke směsi přidá značený oligonukleotidový primer spolu s nezbytnými složkami pro syntézu cDNA specifické sekvence RNA. Primer žíhá s komplementární sekvencí ze směsi. S použitím sekvence nasedající na primer jako templátu syntetizuje enzym reverzní transkriptáza komplementární DNA (cDNA) sekvence RNA. K nasedání primerů a reverzní transkripci dochází pouze tehdy, když je ve vzorku přítomna specifická sekvence RNA. Nakonec, když se provádí denaturační gelová elektroforéza, lze určit velikost sekvence RNA. Je také snadné najít +1 bázi sekvence mRNA (místo zahájení transkripce) metodou extenze primeru. Množství mRNA přítomné ve vzorku lze kvantifikovat touto metodou, pokud je použit nadbytek primeru.
Obrázek 02: Rozšíření primeru
Jaký je rozdíl mezi překladem Nick a Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick translace je proces, který vytváří značené DNA sondy pro různé hybridizační reakce. | Primer extension je technika používaná k nalezení specifické RNA nebo ke studiu genové exprese. |
| Použité enzymy | |
| Používají se enzymy DNáza 1 a DNA polymeráza. | Je použit enzym reverzní transkriptázy. |
| Důležité | |
| Překlad přezdívky usnadňuje označení specifické sekvence DNA. | Rozšíření primeru umožňuje detekci specifické velikosti sekvence mRNA a množství přítomného ve vzorku. |
Shrnutí – Překlad Nick vs Primer Extension
Nick translace je metoda používaná k syntéze značených sond založených na aktivitách enzymů DNázy 1 a E coli DNA polymerázy 1. Je to metoda in vitro používaná v laboratořích před různými hybridizačními technikami. Během translace nicku 5'-3' exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy před nickem a polymerázová aktivita DNA polymerázy 1 nahradí odstraněné nukleotidy značenými nukleotidy za nickem. Extenze primeru je metoda, která se používá k detekci specifického transkriptu RNA ze směsi a kvantifikaci velikosti a množství sledované RNA. Toto je rozdíl mezi překladem přezdívek a rozšířením primeru.
