Klíčový rozdíl mezi translací nicku a endfillingem je v tom, že translace nick je proces, který vytváří značené sondy DNA pro různé hybridizační reakce, zatímco endfilling je technika, která vytváří otupené fragmenty přidáním nukleotidů do jednořetězcových převisů.
Překlad nicku a vyplnění konce jsou dvě techniky používané v molekulární biologii. Translace Nick se používá pro značení sond pro hybridizaci za účelem detekce specifických nukleotidových sekvencí. Koncová výplň se používá k výrobě otupených úlomků, které měly lepkavé konce s jednovláknovými převisy. Obě techniky mají velký význam a běžně se provádějí v molekulárních výzkumných laboratořích.
Co je to Nick Translation?
Nick translace je důležitá technika používaná k přípravě značených sond pro různé molekulárně biologické techniky, jako je blotování, hybridizace in situ, fluorescenční hybridizace in situ atd. Je to metoda značení DNA in vitro. DNA sondy se používají k identifikaci specifických sekvencí DNA nebo RNA. Pomocí značené sondy lze označit nebo zviditelnit specifické fragmenty z komplexní směsi nukleové kyseliny. Proto se značené sondy připravují za použití různých technik. Translace Nicka je jednou z takových metod, která produkuje značené sondy pomocí enzymů DNázy 1 a DNA polymerázy 1.
Obrázek 01: Překlad přezdívky
Proces translace Nicka začíná aktivitou enzymu DNázy 1. DNáza 1 zavádí zářezy do fosfátové kostry dvouřetězcové DNA štěpením fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy. Po vytvoření nicku se vytvoří volná 3′ OH skupina nukleotidu, na kterou bude působit enzym DNA polymeráza 1. 5′ až 3′ exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy z nicku směrem ke 3′ směru vlákna DNA.
Současně funguje polymerázová aktivita enzymu DNA polymerázy 1 a přidává nukleotidy, které nahrazují odstraněné nukleotidy. Pokud jsou nukleotidy značené, dojde k nahrazení značenými nukleotidy a označí DNA pro identifikaci. A konečně, tato nově syntetizovaná značená DNA může být použita jako sondy v různých hybridizačních reakcích.
Co je End Filling?
Koncové plnění je technika používaná v molekulární biologii k výrobě otupených fragmentů. Restrikční trávení produkuje fragmenty s převisy. Tyto fragmenty nemusí být kompatibilní pro ligaci do plazmidových vektorů. Vektory jsou často otupené, aby bylo možné spojit nekompatibilní konce. Proto mohou být fragmenty s přesahy otupeny přidáním nukleotidů ke komplementárnímu vláknu s použitím přesahu jako templátu pro polymeraci. Tento proces je známý jako koncové plnění.
DNA polymerázy jako Klenow fragment DNA polymerázy I a T4 DNA polymerázy katalyzují koncovou výplň. Přidávají nukleotidy k vyplnění (5′ → 3′) a zpětně žvýkají (3′ → 5′). Jakmile jsou lepkavé konce vyplněny, stanou se tupými a jsou připraveny k ligaci do vektoru.
Kromě toho lze koncovou výplň použít ke značení molekul DNA. Lze jej však použít pouze ke značení molekul DNA s lepivými konci. Ve srovnání s překladem nicků je endfill jemnější metoda, která jen zřídka způsobuje zlomy DNA.
Jaké jsou podobnosti mezi překladem přezdívek a vyplňováním konce?
- Překlad nicku i koncové vyplnění jsou techniky molekulární biologie.
- Lze je použít k označení sond.
- Oba jsou in vitro
Jaký je rozdíl mezi překladem přezdívek a vyplňováním konce?
Nick translation je technika, která vytváří značené sondy pro hybridizaci. Naproti tomu endfilling je technika, která vytváří tupé fragmenty pro ligaci do vektorů. Toto je klíčový rozdíl mezi překladem přezdívek a koncovým vyplněním. Kromě toho překlad Nicka vyžaduje použití 5' až 3' exonukleázové aktivity, zatímco koncové plnění nevyžaduje 5' až 3' exonukleázovou aktivitu.
Níže uvedená infografika podrobněji uvádí rozdíly mezi překladem přezdívek a vyplňováním konce.
Shrnutí – Překlad Nicka vs. End Filling
Nick translace je metoda, která začleňuje radioaktivně značené nukleotidy do DNA. Syntetizuje značené sondy založené na aktivitách enzymů DNázy 1 a DNA polymerázy 1 E. coli. Koncové plnění je na druhé straně technika, která vytváří tupé úlomky. Když mají fragmenty lepkavé konce (jednovláknové převisy), je nutné z nich udělat tupé konce, aby se mohly ligovat do vektorů. Koncová výplň přidává kompatibilní nukleotidy a vytváří fragmenty tupých konců, aby byly kompatibilní pro ligaci. Toto shrnuje rozdíl mezi překladem přezdívek a koncovým vyplněním.
