Klíčový rozdíl – tupé vs. lepkavé zakončení ligace
Restrikční endonukleázy jsou specifické enzymy, které štěpí dvouvláknovou DNA (dsDNA). V molekulární biologii jsou také známé jako molekulární nůžky. Restrikční enzymy jsou schopny rozpoznat specifické krátké sekvence dsDNA známé jako rozpoznávací místa a štěpit fosfodiesterové a vodíkové vazby na otevřená dvojvlákna. V důsledku štěpení těmito enzymy se vytvářejí fragmenty DNA s různými typy konců, jako jsou lepkavé konce a tupé konce. DNA ligáza je enzym používaný v molekulární biologii ke spojení dvou sousedních řetězců DNA vytvořením nových vazeb. Krok je známý jako ligace a podle typu ligovaného konce DNA je lze označovat jako ligace tupého konce a ligace lepivých konců. Klíčový rozdíl mezi ligací tupých a lepivých konců je v tom, že k ligaci tupých konců dochází mezi fragmenty DNA, které obsahují dva tupé konce, zatímco k ligaci lepivých konců dochází mezi 5' a 3' převisy. Ve srovnání s ligací tupých konců je ligace lepivých konců účinnější a stabilnější.
Co je ligace tupého konce?
Některé restrikční endonukleázy mohou štěpit DNA na opačných bázích a vytvářet fragmenty DNA s tupými konci. Tyto enzymy jsou známé jako frézy s tupými konci; štěpí se přímo dolů do středu restrikčního místa, aniž by zanechávaly jednovláknové převislé báze. Tupé konce jsou také známé jako nepřevislé konce, protože na koncích nemají 3 'a 5' převislé základny. Oba řetězce končí z párů bází tupými konci. Běžné enzymy pro řezání tupým koncem jsou EcoRV HaeIII, AluI a Smal.
Ligace tupých konců je součástí dvou tupých konců. Nejedná se o podvázání vyčnívajících bází. Tato ligace je méně účinná než ligace lepivých konců. V některých případech se však ligace tupých konců stává výhodnější než ligace lepivých konců, zejména při ligaci produktů PCR. Produkty PCR jsou vždy produkovány s tupými konci. Ligace tupých konců nevyžaduje pro ligaci komplementární konce v DNA.
Obrázek 01: Výroba tupého konce pomocí enzymu Eco RV
Co je ligace lepivého konce?
Některé restrikční endonukleázy jsou schopny štěpit dsDNA a na konci ponechat převislý kousek jednovláknové DNA. Tyto konce jsou známé jako lepkavé nebo převislé konce. K ligaci lepivých konců dochází mezi dvěma fragmenty DNA, které obsahují odpovídající přesahy, protože lepkavé konce mají nepárové báze a k vytvoření vazeb vyžadují komplementární báze. Proto je nutné použít stejný restrikční enzym pro oba zdroje DNA, aby se vytvořily odpovídající ligační fragmenty.
Ligace lepivých konců je účinnější a je často velmi žádoucí při klonovacích procesech. Existuje několik restrikčních enzymů, které produkují lepkavé konce. Jsou to EcoRI, BamHI, HindIII atd.
Obrázek 02: Výroba lepkavých koncovek pomocí enzymu Eco RI
Jaký je rozdíl mezi tupou a lepkavou ligací?
Tupá vs. Ligace lepivého konce |
|
| K ligaci tupých konců dochází mezi dvěma fragmenty DNA s tupými konci. | K ligaci lepivých konců dochází mezi dvěma odpovídajícími fragmenty DNA s lepivými konci. |
| Enzymy | |
| Tupé řezačky produkují tupé konce. | Vykrajovače s lepivými konci vytvářejí lepkavé nebo soudržné konce. |
| Požadavek na shodu konců | |
| Nevyžaduje odpovídající fragmenty nebo komplementární báze. | K vytvoření párů bází vyžaduje komplementární báze na koncích. |
| Účinnost | |
| Je to méně účinné než ligace lepivých konců | Je to účinnější než ligace tupých konců. |
Shrnutí – Tupá vs. Ligace lepkavého konce
Restrikční endonukleázy jsou schopny štěpit dsDNA a produkovat fragmenty DNA s různými konci. Rozpoznají specifické sekvence a omezí DNA a vytvoří lepkavé a tupé konce. Lepivé konce mají na konci fragmentů nepárové báze. Tupé konce vznikají díky rovnému štěpení a na koncích mají páry bází. Ligace lepivých konců vyžaduje dva komplementární kusy jednovláknové DNA. K ligaci tupých konců dochází mezi jakýmikoli dvěma fragmenty tupých konců. Toto je rozdíl mezi tupou a lepkavou ligací.
