Klíčový rozdíl – PCR primery vs. sekvenační primery
S nedávným vývojem v oblasti molekulární biologie byly vyvinuty různé genetické techniky, které usnadnily a zpřesnily procesy zkoumání různých směrů předmětu. PCR a další sekvenační postupy jsou dvě důležité takové techniky. Používají různé dílčí komponenty. Primery jsou považovány za hlavní podsložku společnou pro techniky PCR i sekvenování. PCR primery se používají pro amplifikaci konkrétní sekvence DNA, zatímco sekvenační primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifické pořadí nukleotidové sekvence. Toto je klíčový rozdíl mezi PCR primery a sekvenačními primery.
Co jsou primery PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je genetická technika, která se používá v oblasti molekulární biologie k amplifikaci jedné nebo několika kopií určitého segmentu DNA ak získání mnoha milionů identických kopií. V PCR reakci se používají různé složky včetně primerů. Primery jsou krátké řetězce DNA s nukleotidovou délkou 18-25, což je činí kompatibilními se startovací a koncovou oblastí DNA fragmentů, které mají být amplifikovány. Primery mohou být přímý primer a reverzní primer. Tyto primery se vážou na fragment DNA ve specifických bodech, kde se DNA polymeráza naváže na specifický primer v místě a iniciuje syntézu nového řetězce DNA.
Výběr primerů je důležitým aspektem procesu PCR. Důležitá je volba délky primeru. Ideální délka by byla 18-25 nukleotidů. Pokud je délka příliš krátká nebo příliš dlouhá, primery se nenavážou na sekvenci DNA, která má být amplifikována přesně. Primery, které jsou příliš krátké, vedou k nespecifickému nasedání primerů na různých místech sekvence DNA.
Obrázek 01: PCR primery
Obsah guaninu a cytosinu (GC) v dobrém primeru by měl být v rozmezí 40-60. Teplota nasedání primeru a teplota tání jsou životně důležité faktory během PCR. Teplota tání by měla být vypočtena přesně a teplota žíhání primeru by měla být o 5 0C nižší než teplota tání. Teplota tání by měla být 60 °C a 75 °C. Příliš vysoké nebo příliš nízké teploty budou mít za následek méně aktivní aktivitu DNA polymerázy.
Co jsou sekvenační primery?
Sekvenační primery se používají v souvislosti se sekvenováním fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. Pro získání dobrých výsledků sekvenování jsou důležité vysoce kvalitní primery a templáty. Když jsou tedy vybrány primery, měly by být jedinečné pro konkrétní oblast, kterou chceme sekvenovat. Také by měla být se správnou orientací tam, kde jsou sekvence obvykle generovány od 3' do 5' konců primerů. Sekvence by měla postrádat nežádoucí autohybridizaci, jako je tvorba vlásenkových smyček. Neměl by obsahovat po sobě jdoucí tvorbu guaninových bází.
Teplota tání (Tm) primeru musí být vhodná pro podmínky sekvenování. Proto by měla ležet mezi 52oC a 74oC. Příprava oligonukleotidů pro použití jako primer by měla být purifikována, aby se získala požadovaná sekvence v plné délce. Pokud oligonukleotidy obsahují nečistoty, signalizace sekvence primeru bude superponována z různých míst primeru a také to sníží počet základních buněk.
Obrázek 02: Sekvenční primery
Teplota tání primeru (Tm) oligonukleotidu určuje, jak silně jsou vzájemně hybridizovány komplementární řetězce DNA. Tm lze považovat za termodynamický výpočet, kde je závislá jak na sekvencích DNA, tak na několika podmínkách, jako je koncentrace soli. Tm je důležitá během PCR, kde se používá varianta nazývaná sekvenování cyklu k produkci skupiny fragmentů zakončených dideoxynukleotidem. Zde bude primer, který je sekvenován, zpočátku alternativně hybridizován, poté prodloužen a nakonec denaturován pro amplifikaci. Proto by hodnota Tm měla být v rozmezí 52oC a 74o C. Syntetizované oligonukleotidy lze získat z laboratoří pro syntézu DNA/RNA podle výběr. Malý rozsah syntézy, který se používá pro sekvenování DNA, je obvykle 50 nmol. Nejdůležitější je také, aby primery použité pro sekvenování byly čištěny, aby neobsahovaly nečistoty, které zabrání snížení kvality.
Jaké jsou podobnosti mezi primery PCR a primery sekvenování?
- Primery PCR i primery sekvenování jsou primery, které se používají v procesu amplifikace cílené sekvence DNA.
- Primery PCR i primery sekvenování se skládají z nukleotidů.
- Primery PCR i primery sekvenování jsou krátké oligomery.
Jaký je rozdíl mezi PCR primery a sekvenačními primery?
Primery PCR vs sekvenační primery |
|
| PCR primery jsou krátké řetězce DNA s délkou nukleotidové sekvence 18-25, díky čemuž jsou kompatibilní se startovací a koncovou oblastí DNA fragmentů, které mají být amplifikovány. | Sekvenační primery jsou krátké oligomery, které se používají v souvislosti se sekvenováním fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. |
| Funkce | |
| PCR primery se používají pro amplifikaci konkrétní sekvence DNA. | Sekvenační primery se používají v kontextu sekvenování fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. |
| Počet potřebných primerů | |
| Dva základní nátěry; jeden dopředný primer a jeden reverzní primer se používají jako primery PCR. | Potřebuje pouze jeden primer jako sekvenační primer. |
Shrnutí – PCR primery vs sekvenační primery
Sekvenační primery se používají v souvislosti se sekvenováním fragmentu DNA se záměrem odhalit jeho specifickou identitu. Pro spuštění procesu bude stačit jeden sekvenační primer. Pro získání dobrých výsledků sekvenování jsou důležité vysoce kvalitní primery a templáty. Když jsou tedy vybrány primery, měly by být jedinečné pro konkrétní oblast, kterou chceme sekvenovat. PCR primery jsou krátké řetězce DNA s nukleotidovou délkou 18-25, které jsou kompatibilní s počáteční a koncovou oblastí fragmentů DNA, které mají být amplifikovány. PCR primery mohou být přímý primer a reverzní primer. Obsah guaninu a cytosinu (GC) v dobrém primeru by měl být v rozmezí 40-60. Teplota nasedání primeru a teplota tání jsou životně důležité aspekty během PCR. Toto je rozdíl mezi PCR primery a sekvenačními primery.
