Klíčový rozdíl mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy je v tom, že konvenční PCR je technika vyvinutá k amplifikaci specifických sekvencí DNA a nested PCR je modifikace konvenční PCR, která se skládá ze dvou sekvenčních amplifikačních reakcí, zatímco skutečná -time PCR je variantou konvenční PCR, která je schopna kvantifikovat amplifikovaný produkt.
PCR je velmi běžná vědecká technika široce používaná ve výzkumu a medicíně k detekci DNA. PCR testy se používají k detekci antigenů pomocí detekce jejich DNA nebo RNA. Obecně je virová RNA přítomna v těle před detekcí protilátek nebo před zobrazením příznaků onemocnění. Test PCR může zjistit, zda někdo má nebo nemá virus brzy. V současné době je PCR standardním testem pro detekci onemocnění COVID-19. Existují různé typy PCR technik, jako je real-time PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR a long-range PCR, atd.
Co jsou konvenční testy PCR?
Konvenční PCR test je technika amplifikace DNA in vitro běžně prováděná v molekulárně biologických laboratořích. Tato metoda umožnila výrobu tisíců až milionů kopií konkrétního fragmentu DNA. Kary Mullis představil tuto techniku v roce 1980. Tato technika vyžaduje fragment DNA známý jako templát, aby bylo možné vytvořit mnoho jeho kopií. Taq polymeráza funguje jako enzym DNA polymeráza a katalyzuje syntézu nových řetězců templátové sekvence.
Primery ve směsi PCR budou fungovat jako výchozí body pro prodloužení fragmentů. Všechny ingredience, které jsou nezbytné k vytvoření kopií DNA, jsou zahrnuty do PCR směsi. PCR reakce probíhá v PCR stroji a měla by být napájena správnou PCR směsí a správným PCR programem. Pokud jsou reakční směs a program správné, vytvoří požadovaný počet kopií určité části DNA z velmi malého množství DNA.
Obrázek 01: Konvenční PCR test
Reakce PCR zahrnuje tři hlavní kroky: denaturaci, nasedání primeru a prodloužení řetězce. Tyto tři kroky probíhají při třech různých teplotách. PCR pufr udržuje optimální podmínky pro působení Taq polymerázy. Tyto tři stupně PCR reakce se opakují, aby se vytvořilo požadované množství produktu PCR. Při každé PCR reakci se počet kopií DNA zdvojnásobí. V PCR lze tedy pozorovat exponenciální amplifikace. Produkt PCR lze rozdělit pomocí gelové elektroforézy, protože produkuje viditelné množství DNA na gelu a lze jej purifikovat pro další studie, jako je sekvenování.
PCR je cenným nástrojem v lékařském a biologickém výzkumu. Zejména ve forenzních studiích má PCR nesmírnou hodnotu, protože může amplifikovat DNA pro studie z malých vzorků zločinců a vytvářet forenzní profily DNA. PCR je široce používána v mnoha oblastech molekulární biologie včetně genotypizace, klonování genů, detekce mutací, sekvenování DNA, mikročipů DNA a testování otcovství.
Co jsou vnořené PCR testy?
Nested PCR je typ PCR, který snižuje nespecifickou amplifikaci DNA. V testu nested PCR existují dvě po sobě jdoucí PCR nebo dvě sekvenční amplifikační reakce. Během první amplifikační reakce vzniká produkt PCR. Po první reakci se na PCR produktu první reakce provede druhá amplifikační reakce. Proto se primery ve druhé reakční směsi vážou s prvním produktem PCR a amplifikují jej.
Obrázek 02: Nested PCR
Páry primerů se v každé reakci liší. Nespecifická vazba primerů je snížena v nested PCR. Nested PCR testy jsou užitečné pro zvýšení citlivosti a/nebo specificity. Nested PCR však vyžaduje znalosti o zainteresované sekvenci.
Co jsou testy PCR v reálném čase?
Real-time PCR neboli kvantitativní PCR (Q PCR) je upravená verze PCR, která kvantitativně měří produkty PCR. Proto tato technika kvantifikuje amplifikaci v reálném čase pomocí stroje PCR v reálném čase. Je to také vhodná metoda pro stanovení množství cílové sekvence nebo genu přítomného ve vzorku.
Zajímavou vlastností real-time PCR je to, že kombinuje amplifikaci i skutečnou kvantifikaci do jediného kroku. Proto může být potřeba gelové elektroforézy pro detekci eliminovat technikou real-time PCR. Použití fluorescenčních barviv ke značení produktů PCR během reakcí PCR nakonec povede k přímé kvantifikaci. Když se shromažďují produkty PCR, shromažďují se také fluorescenční signály a budou měřeny strojem v reálném čase. SYBR Green a Taqman jsou dvě metody pro detekci nebo sledování procesu amplifikace PCR v reálném čase. Obě metody monitorují průběh procesu amplifikace a hlásí množství produktu v reálném čase.
Obrázek 03: Real-Time PCR
PCR v reálném čase má širokou škálu aplikací, jako je kvantifikace genové exprese, analýza mikroRNA a nekódující RNA, genotypizace SNP, detekce variant počtu kopií, detekce vzácných mutací, detekce geneticky modifikovaných organismů a detekce infekčních agens.
Jaké jsou podobnosti mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy?
- Vnořené a real-time PCR testy jsou modifikace konvenčního PCR testu.
- Všechny tři techniky amplifikují vzorky DNA.
- Jejich produkty lze použít při sekvenování nebo analýze.
- Tyto testy vyžadují primery.
Jaký je rozdíl mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy?
Konvenční PCR je technika vyvinutá k amplifikaci specifických sekvencí DNA. Mezitím je Nested PCR modifikací konvenční PCR, která se skládá ze dvou sekvenčních amplifikačních reakcí, a PCR v reálném čase je variantou konvenční PCR, která je schopna kvantifikovat amplifikovaný produkt. Toto je klíčový rozdíl mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy. Na rozdíl od konvenční a real-time PCR používá nested PCR dvě sady primerů. Kromě toho existují dvě po sobě jdoucí amplifikační reakce v nested PCR, aby se snížila nespecifická amplifikace. kromě toho konvenční a real-time PCR testy neobsahují dvě sekvenční amplifikační reakce.
Následující infografika uvádí rozdíly mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy v tabulkové formě pro srovnání vedle sebe.
Shrnutí – Konvenční vs. Nested vs. Real-time PCR Assays
Konvenční PCR je první technika vyvinutá pro amplifikaci specifických fragmentů DNA. Nested PCR a real-time PCR jsou dvě varianty konvenční PCR. Existují dvě sekvenční amplifikační reakce a použití dvou sad primerů v nested PCR. Real-time PCR je vyvinuta pro kvantifikaci amplifikovaného produktu PCR. Toto shrnuje rozdíl mezi konvenčními vnořenými a real-time PCR testy.
