Klíčový rozdíl mezi RP HPLC a HIC spočívá v tom, že RP HPLC používá polární mobilní fázi a méně polární stacionární fázi. Zatímco HIC používá hydrofobní stacionární fázi, která umožňuje hydrofobním molekulám se k ní připojit.
Chromatografie je analytická technika, která pomáhá rozdělit směs na její složky. Nejprve musíme rozpustit vzorek, který má být separován, na roztok. Tato směs roztok-látka se nazývá mobilní fáze. Poté mobilní fáze prochází dalším materiálem, který se nazývá stacionární fáze. Stacionární fáze určuje separaci složek. K separaci dochází v důsledku rozdělování materiálu mezi mobilní fázi a stacionární fázi.
Co je RP HPLC?
Pojem RP HPLC je zkratka pro reverzní fázovou vysoce výkonnou kapalinovou chromatografii. Jedná se o separaci složek ve směsi podle hydrofobnosti. Hydrofobní složky v mobilní fázi se spojují s imobilizovanými hydrofobními ligandy na stacionární fázi, zatímco hydrofilní složky se eluují přes stacionární fázi, aniž by se přichytily k povrchu stacionární fáze.
Obrázek 01: Zařízení HPLC
Tato metoda má navíc ve srovnání s jinými chromatografickými technikami větší reprodukovatelnost a rovněž vykazuje širokou použitelnost. Proto tuto metodu v laboratořích používáme u více než 75 % všech metod HPLC. Jako mobilní fázi většinou používáme vodnou směs vody s mísitelným polárním organickým rozpouštědlem. Zajistí tak přichycení hydrofobních složek v roztoku k povrchu stacionární fáze.
Co je HIC?
Termín HIC znamená hydrofobní interakční chromatografii. Jedná se o typ HPLC s reverzní fází a tato metoda se používá především pro separaci velkých biomolekul, jako jsou proteiny. Při této metodě potřebujeme k výrobě vzorku biomolekuly použít vodné médium. Je to proto, že organická rozpouštědla mohou způsobit denaturaci proteinů. Navíc tato technika využívá interakci mezi velkými molekulami s mírně hydrofobním povrchem stacionární fáze. Kromě toho musíme ve vzorku použít vysokou koncentraci soli, protože to podporuje zadržování proteinu na obalu; tento proces se nazývá vysolování. Postupným snižováním koncentrace soli můžeme zajistit, aby se biomolekuly eluovaly odděleně podle jejich hydrofobnosti.
Tato metoda obvykle používá podmínky opačné než u iontoměničové chromatografie. Při této technice nejprve potřebujeme projít kolonou roztok pufru, abychom snížili solvataci rozpuštěné látky ve vzorku. To způsobí, že hydrofobní oblasti proteinu jsou vystaveny. Pokud je však molekula více hydrofobní, k podpoře vazby je zapotřebí méně soli. Zde se jako první eluují méně hydrofobní soluty a podle změny koncentrace soli se hydrofobnější soluty eluují jako poslední.
Jaký je rozdíl mezi RP HPLC a HIC?
Chromatografie je analytická technika pro separaci složek ve směsi. RP HPLC a HIC jsou dvě specializované chromatografické techniky. Klíčový rozdíl mezi RP HPLC a HIC je v tom, že RP HPLC používá polární mobilní fázi a méně polární stacionární fázi, zatímco HIC používá hydrofobní stacionární fázi, která umožňuje hydrofobním molekulám se na ni připojit.
Níže uvedená infografika shrnuje rozdíl mezi RP HPLC a HIC.
Shrnutí – RP HPLC vs. HIC
Chromatografie je analytická technika pro separaci složek ve směsi. RP HPLC a HIC jsou dvě specializované chromatografické techniky. Klíčový rozdíl mezi RP HPLC a HIC je v tom, že RP HPLC používá polární mobilní fázi a méně polární stacionární fázi, zatímco HIC používá hydrofobní stacionární fázi, která umožňuje hydrofobním molekulám se k ní připojit.
