Klíčový rozdíl mezi chromatofokusací a izoelektrickou fokusací je v tom, že chromatofokusace je typ metody sloupcové chromatografie, která využívá iontoměničové pryskyřice, zatímco izoelektrická fokusace je typ elektroforézy, která využívá imobilizované gely s gradientem pH.
Chromatofokusace a izoelektrická fokusace jsou dvě techniky, které oddělují proteiny podle jejich izoelektrických bodů. Chromatofokusace i izoelektrická fokusace mají velkou rozlišovací schopnost. Chromatofocusing je metoda sloupcové chromatografie s vysokým rozlišením, zatímco izoelektrická fokusace je metoda elektroforetické separace. Chromatofokusace navíc nepoužívá elektrické pole, zatímco izoelektrická fokusace potřebuje elektrické pole.
Co je to Chromatofocusing?
Chromatofocusing je typ vysokoeluční chromatografie, která odděluje proteiny podle rozdílů v jejich izoelektrickém bodu. Využívá kolonu s iontoměničovou pryskyřicí a interně vyvinutý gradient pH. Na rozdíl od izoelektrické fokusace nezahrnuje chromatofokusování elektrické pole. Chromatofocusing je výkonná purifikační technika, která dokáže rozlišit velmi podobné molekuly, i když se liší pouze o 0,02 jednotek pH. Proto je chromatofokusace nejvhodnější jako konečný leštící krok, když je vyžadováno vysoké rozlišení při separaci velmi podobných složek.
Při chromatofokusaci se vzorek nanáší na kolonu smícháním se startovacím pufrem. Proteiny, které mají pH nad svým izoelektrickým bodem, jsou záporně nabité a zůstávají blízko vrcholu kolony, zatímco jiné proteiny, které mají pH pod svým izoelektrickým bodem, migrují kolonou dolů. Protein s nejvyšším izoelektrickým bodem je eluován jako první, zatímco protein s nejnižším izoelektrickým bodem je eluován z kolony jako poslední. Tato technika je ovlivněna několika faktory, jako je precipitace proteinů a linearita gradientu pH.
Co je to izoelektrické zaostřování?
Izoelektrická fokusace je technika, která odděluje různé molekuly na základě jejich izoelektrického bodu. Je také známé jako elektrofocusing. Tato technika se často používá pro separaci proteinů v gelu. Při izoelektrické fokusaci se vzorek přidá do gelů s imobilizovaným pH gradientem (IPG). IPG gel je akrylamidová gelová matrice kopolymerovaná s gradientem pH. Proteiny migrují směrem ke katodě, dokud nenajdou oblast pH svých izoelektrických bodů. Když protein dosáhne pH, které nemá žádný čistý náboj, migrace se zastaví a vytvoří se stacionární pás. Podobně každý protein vytváří pruh v bodě gradientu pH odpovídající jeho izoelektrickému bodu.
Obrázek 01: Izoelektrické zaostřování
Izoelektrická fokusace je prvním krokem dvourozměrné gelové elektroforézy. Při této technice jsou proteiny nejprve separovány podle jejich izoelektrických bodů izoelektrickou fokusací a poté separovány podle jejich molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE.
Jaké jsou podobnosti mezi chromatofokusem a izoelektrickým zaostřováním?
- Chromatofokusace a izoelektrické zaostřování jsou dvě vysoce rozlišující metody.
- Oba jsou založeny na izoelektrickém bodu proteinů.
- Tyto techniky používají gradient pH.
- Oba postupy jsou informativní pro charakterizaci variant lidského hemoglobinu.
- Dokážou rozlišit molekuly, kde se hodnoty pI liší jen o 0,02 jednotek pH.
Jaký je rozdíl mezi chromatofokusem a izoelektrickým zaostřováním?
Chromatofocusing je technika sloupcové chromatografie s vysokým rozlišením, která odděluje proteiny podle jejich izoelektrického bodu. Naproti tomu izoelektrická fokusace je elektroforetická technika, která odděluje proteiny podle jejich izoelektrického bodu aplikací elektrického pole podél pH gradientu vytvořeného v kapiláře. Toto je klíčový rozdíl mezi chromatofokusem a izoelektrickým zaostřováním.
Další rozdíl mezi chromatofokací a izoelektrickou fokusací je ten, že chromatofokus nezahrnuje elektrické pole, zatímco izoelektrická fokusace potřebuje elektrické pole.
Shrnutí – Chromatofocusing vs. Isoelectric Focusing
Chromatofokusace a izoelektrická fokusace jsou dvě podobné techniky, které mají vysokou rozlišovací schopnost molekul, zejména velmi podobných molekul. Chromatofocusing je technika sloupcové chromatografie s vysokým rozlišením, zatímco izoelektrická fokusace je metoda elektroforézy. Chromatofokusace nezahrnuje elektrické pole, na rozdíl od izoelektrické fokusace. Toto shrnuje rozdíl mezi chromatofokusem a izoelektrickým zaostřováním.
