Klíčový rozdíl – klonování genů vs PCR
Syntéza mnoha kopií DNA ze specifického fragmentu DNA se nazývá amplifikace DNA. Existují dva hlavní procesy amplifikace DNA, a to genové klonování a PCR. Klíčový rozdíl mezi genovým klonováním a PCR je v tom, že genové klonování produkuje mnohočetné kopie specifického genu in vivo vytvořením rekombinantní DNA a pěstováním uvnitř hostitelské bakterie, zatímco PCR produkuje miliony kopií specifického fragmentu DNA in vitro, které procházejí opakovanými cykly denaturace a syntéza.
Co je klonování genů?
Klonování genů je technika používaná k lokalizaci a množení specifického genu z extrahované genomové DNA organismu prostřednictvím konstrukce rekombinantní DNA. Genomová DNA obsahuje tisíce různých genů kódovaných pro proteiny. Když je DNA extrahována, obsahuje všechny možné geny, které může nést. Technika klonování genů umožnila detekci specifického genu z celkové DNA. Proto klonování genů slouží jako důležitý nástroj v molekulární biologii.
Vytvoření genomové knihovny organismu je při klonování genů zásadní, pokud neexistuje ponětí o umístění příslušného genu v DNA. Genomická knihovna se vytvoří pomocí následujících kroků.
Krok 1: Extrakce celkové DNA z organismu, který obsahuje požadovaný gen.
Krok 2: Omezte štěpení extrahované DNA za účelem vytvoření malých zvládnutelných fragmentů. Tento krok usnadňují restrikční endonukleázy.
Krok 3: Výběr vhodného vektoru a otevření vektorové DNA pomocí stejných restrikčních endonukleáz. Bakteriální plazmidy se běžně používají jako vektory pro přenášení cizí DNA. Plazmidy jsou malé kruhy DNA umístěné uvnitř bakterií.
Krok 4: Kombinace vektorové DNA a fragmentované DNA za vzniku rekombinantní molekuly DNA. Tento krok je řízen DNA ligázou.
Krok 5: Přenos molekul rekombinantní DNA do hostitelských bakterií. Tento krok je známý jako transformace a provádí se pomocí tepelného šoku.
Krok 5: Screening transformovaných bakteriálních buněk na kultivačním médiu. Na konci transformačního procesu se získá smíšená populace transformovaných a netransformovaných hostitelských buněk. Gen zájmu zahrnuje pouze transformované hostitelské buňky. Proto je nutné vybrat transformované buňky. Selekce se provádí pomocí selektivních médií, která obsahují antibiotika. Pouze transformované buňky rostou na tomto screeningovém médiu umožňujícím selekci.
Krok 6: Pěstování bakterií za účelem produkce genové knihovny. V tomto kroku se transformované hostitelské buňky zavedou do čerstvého kultivačního média, které poskytuje optimální růstové požadavky. Celkový počet kolonií na kultivačních miskách představuje genomickou knihovnu tohoto organismu.
Krok 7: Molekula rekombinantní DNA obsahující požadovaný gen musí být testována z tisíců klonovaných fragmentů rekombinantní DNA. Toho lze dosáhnout použitím sond, které označí specifický gen nebo specifický protein z tohoto genu.
Jakmile je zainteresovaný gen obsahující bakteriální kolonii identifikován z celkového počtu kolonií, je možné vytvořit miliony kopií rekombinantního plazmidu, který tento gen obsahuje.
Klonování genů se používá při zakládání genových knihoven, produkci speciálních proteinů, vitamínů, antibiotik, hormonů, sekvenování a mapování genomů organismů, vytváření více kopií DNA jednotlivců ve forenzních studiích atd.
Obrázek_1: Klonování genů
Co je to PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika, která vytváří velké množství kopií konkrétního fragmentu DNA. Exponenciální amplifikace specifické sekvence DNA se získá pomocí PCR za podmínek in vitro. Tato technika je velmi mocným nástrojem v molekulární biologii, protože dokáže rozmnožit malý vzorek DNA na použitelné množství. PCR zavedl Kary Mullis v roce 1983 a tento oceněný vynález vytvořil obrovský pokrok v molekulární biologii.
PCR technika sleduje opakované PCR reakce, jak je znázorněno na obrázku 02. Jedna PCR reakce se skládá ze tří hlavních kroků probíhajících při třech různých teplotách; denaturace dvouřetězcové DNA při 94 0C, nasedání primerů při 68 0C a prodloužení řetězce při 72 0 C. Proto by při provádění PCR mělo být pro správnou replikaci vysoce udržováno kolísání teploty. PCR se provádí v PCR stroji uvnitř PCR zkumavek. PCR zkumavky jsou naplněny správnými PCR směsmi obsahujícími templátovou DNA, Taq polymerázu, primery, dNTP a pufr. Denaturace dvouřetězcové DNA vzorku na jednořetězcovou DNA se provádí přerušením vodíkových vazeb mezi komplementárními bázemi při 94 – 98 0C. Poté jsou jednotlivé řetězce templátové DNA vystaveny primerům. Měl by být poskytnut pár primerů (vpřed a vzad), které by měly být termostabilní, aby tolerovaly vysoké teploty. Primery jsou jednořetězcové krátké sekvence DNA komplementární ke koncům cílového fragmentu DNA. V PCR se používají syntetické primery. Primery se vážou s komplementárními bázemi vzorku DNA a iniciují syntézu nového vlákna. Tento krok je katalyzován enzymem zvaným Taq polymeráza; termostabilní enzym DNA polymeráza izolovaný z Thermus auqaticus. Když jsou dostupné primery a nukleotidy (stavební bloky), Taq polymeráza zkonstruuje nový řetězec DNA komplementární k templátové DNA. Na konci programu PCR je amplifikovaný fragment DNA pozorován pomocí gelové elektroforézy. Pokud je nutná další analýza, produkt PCR se z gelu vyčistí.
PCR je velmi užitečná pro diagnostiku a sledování genetických a získaných onemocnění, identifikaci pachatelů (v oblasti forenzní vědy), studium struktury a funkce cíleného segmentu DNA, sekvenování a mapování genomů organismů, atd. PCR se mezi vědci stala rutinní laboratorní technikou v lékařských a molekulárně biologických výzkumných laboratořích, protože má širokou škálu aplikací.
Obrázek_2: Polymerázová řetězová reakce
Jaký je rozdíl mezi klonováním genů a PCR?
Klonování genů vs PCR |
|
| Klonování genu je proces vytváření více kopií specifického genu in vivo prostřednictvím rekombinantní DNA a transformace na hostitelskou bakterii. | Technika PCR vytváří více kopií konkrétní sekvence DNA in vitro prostřednictvím opakovaných cyklů reakcí PCR. |
| Požadavek na konstrukci rekombinantní DNA | |
| Rekombinantní DNA se vyrábí za účelem lokalizace genu. | Rekombinantní DNA se nevyrábí. |
| Potřeba práce | |
| Tento proces je náročný na práci. | Intenzivní práce není potřeba. |
| Proces in vivo nebo in vitro | |
| Konstrukce rekombinantní DNA je in vitro a amplifikace DNA je in vivo. | Amplifikace DNA probíhá zcela in vitro. |
Shrnutí – Klonování genů vs PCR
Klonování genů a PCR jsou dvě metody používané pro amplifikaci DNA. PCR je proces in vitro, který vytváří více kopií DNA určitého fragmentu DNA bez použití rekombinantní DNA a hostitelského organismu. Klonování genu je primárně proces in vivo, jehož výsledkem je mnoho kopií zainteresovaného genu uvnitř hostitelského organismu prostřednictvím konstrukce rekombinantní DNA. Toto je rozdíl mezi klonováním genů a PCR.
