Klíčový rozdíl – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green a Taqman jsou dvě metody používané k detekci nebo sledování amplifikačního procesu PCR v reálném čase. SYBR Green je metoda založená na interkalačním barvivu pro barvení nukleových kyselin, zatímco Taqman je metoda založená na hydrolyzační sondě. Obě technologie jsou navrženy tak, aby generovaly fluorescenci během PCR, což umožňuje zařízení PCR v reálném čase sledovat reakci v „reálném čase“. Metoda SYBR Green se provádí pomocí fluorescenčního barviva zvaného SYBR green a detekuje amplifikaci navázáním barviva na produkovanou dvouvláknovou DNA. Taqman se provádí pomocí duálně značených sond a detekuje amplifikaci degradací sondy Taq polymerázou a uvolňováním fluoroforu. Toto je klíčový rozdíl mezi SYBR Green a Taqman.
Co je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescenční barvivo používané k barvení nukleových kyselin, zejména dvouřetězcové DNA v molekulární biologii. Metoda SYBR Green se používá ke kvantifikaci produktů PCR během PCR v reálném čase. Jakmile se naváže na DNA, výsledný komplex DNA-barvivo absorbuje modré světlo a vyzařuje intenzivní zelené světlo. Stává se to kvůli strukturální změně, ke které dochází v molekule barviva po vazbě s dvouvláknovou DNA. Když PCR vytváří více a více DNA, více molekul barviva se váže s DNA a generuje více fluorescence. Proto se fluorescence zvyšuje s akumulací produktu PCR. Množství produktu PCR lze tedy kvantitativně měřit pomocí zelené fluorescenční detekce SYBR.
Zelené barvivo SYBR lze také použít pro značení DNA v cytometrii a fluorescenční mikroskopii. Ethidium bromid byl úspěšně nahrazen SYBR Green, protože Ethidium bromid je karcinogenní barvivo s problémy s likvidací během vizualizace DNA v gelové elektroforéze.
Zelená metoda SYBR má své výhody a nevýhody. Tato metoda je velmi citlivá, levná a snadno použitelná. Avšak díky své schopnosti vázat se na jakoukoli dvouvláknovou DNA může nespecifická vazba vést k nadměrné kvantifikaci produktu PCR.
Obrázek 01: Zelená technika SYBR
Co je Taqman?
Taqman je alternativní metoda k SYBR Green pro monitorování procesu PCR v reálném čase. Tato metoda závisí na 5' – 3' exonukleázové aktivitě enzymu Taq polymerázy k degradaci sond během prodlužování nového vlákna a uvolňování fluoroforu. V této metodě se používají duálně značené sondy a je založena na hydrolýze sond. Sondy jsou fluorescenčně značené DNA oligonukleotidy, které mají fluorescenční reportérovou molekulu (fluorofor) na 5' konci a zhášecí molekulu na 3' konci. Jsou navrženy tak, aby se navázaly na jednořetězcový templát na opačné straně nasedání primeru. Taq polymeráza přidává nukleotidy k primeru a prodlužuje nový řetězec směrem k duálně značeným sondám. Jakmile se Taq polymeráza setká se sondou, exonukleázové působení Taq polymerázy aktivuje a degraduje sondu. Jakmile dokončí syntézu nového vlákna, sonda se podrobí úplné degradaci a uvolní fluorofor. Uvolnění fluoroforu vytváří fluorescenci. Molekula fluorescenčního zhášeče účinně zháší emitované světlo a vytváří výstup pro kvantifikaci produktu PCR. Uvolňování fluoroforů a množství produktů PCR jsou úměrné. Proto lze kvantifikaci snadno provést metodou Taqman.
Obrázek 02: Metoda Taqman
Taqman metoda se používá v real time PCR, kvantifikaci genové exprese, detekci genetických polymorfismů, kvantifikaci delecí chromozomální DNA, identifikaci bakterií, verifikace microarray analýzy, SNP genotypizaci atd.
Jaký je rozdíl mezi SYBR green a Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green je založen na barvivu vázajícím DNA. | Taqman závisí na hybridizačních sondách a 5' až 3' exonukleázové aktivitě Taq polymerázy. |
| Fluorescentně značené sondy | |
| Žádné fluorescenčně označené sondy nejsou vyžadovány. | Vyžadují se sondy se dvěma značkami. |
| Multiplexní genová analýza | |
| Nelze jej použít pro cíle multiplexních genů. | Lze jej použít pro cíle multiplexních genů. |
| Cost | |
| Toto je levnější. | Toto je dražší. |
| Specificita | |
| Toto je méně specifické a váže se s jakoukoli dvouřetězcovou DNA | Jsou vysoce specifické, protože sondy detekují specifické amplifikační produkty. |
| Účinnost | |
| Toto je méně účinné. | Toto je vysoce efektivní. |
| Aplikace | |
| Toto se používá při PCR v reálném čase, vizualizaci na agarózovém gelu, značení DNA atd. | Toto se používá v reálném čase PCR, kvantifikaci genové exprese, detekci genetických polymorfismů atd. |
Shrnutí – SYBR Green a Taqman
Taqman a SYBR green jsou dvě metody používané v real-time PCR (kvantitativní PCR). Obě metody umožňují efektivní kvantifikaci produktu PCR a spoléhají na emisi fluorescence. Metoda Taqman využívá duálně značené sondy pro detekci nahromaděné DNA, zatímco metoda SYBR Green používá fluorescenční barvivo. Obě tyto metody mají také různé aplikace v molekulární biologii.
