Klíčový rozdíl – RT PCR vs QPCR
Polymerázová řetězová reakce je technika používaná k amplifikaci specifické oblasti DNA in vitro. Díky vynálezu této techniky Kary Mullis v roce 1983 jsou vědci schopni vyrobit tisíce až miliony kopií specifických fragmentů DNA pro výzkumné účely. V současné době se stala běžnou a rutinně používanou technikou v klinických a výzkumných laboratořích pro širokou škálu aplikací. Existují variace tradičních technik PCR, jako je RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR atd. RT PCR a Q PCR jsou dvě důležité varianty PCR. Klíčový rozdíl mezi RT PCR a Q PCR je v tom, že RT PCR se používá k detekci genové exprese vytvořením komplementárních DNA (cDNA) transkriptů z RNA, zatímco Q PCR se používá ke kvantitativnímu měření produktů PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv.
Co je RT PCR?
Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT PCR) je variantou PCR, která se používá k detekci exprese RNA. Je to velmi důležitá metoda pro detekci exprese mRNA v tkáních. RT PCR se používá, když je výchozím materiálem vzorku RNA. Při RT PCR se templátová mRNA nejprve převede na komplementární DNA. Tento krok je katalyzován enzymem reverzní transkriptázou a proces je známý jako reverzní transkripce. Za druhé, tradiční PCR se používá pro nově syntetizovanou cDNA pro amplifikaci.
RT PCR je vysoce citlivá technika, která vyžaduje relativně malé množství vzorku RNA. RT PCR se běžně používá při diagnostice a kvantifikaci druhů RNA, zejména RNA virů, jako je virus lidské imunodeficience a virus hepatitidy C.
Obrázek 01: Technika RT PCR
Co je QPCR?
Kvantitativní PCR (QPCR) je varianta PCR, která se používá ke kvantitativnímu měření produktů PCR. Je také označována jako polymerázová řetězová reakce v reálném čase, protože měří amplifikaci v reálném čase pomocí stroje PCR v reálném čase. Je to vhodná metoda pro stanovení množství cílové sekvence nebo genu přítomného ve vzorku. Zajímavou vlastností QPCR je, že kombinuje amplifikaci i skutečnou kvantifikaci do jediného kroku. Proto může být potřeba gelové elektroforézy při detekci eliminovat technikou QPCR. QPCR používá fluorescenční barviva ke značení produktů PCR během reakcí PCR, které nakonec vedou k přímé kvantifikaci. Když se produkty PCR akumulují, shromažďují se také fluorescenční signály a budou měřeny strojem reálného času. QPCR lze kombinovat s RT PCR. Je známá jako RT – QPCR nebo QRT – PCR a je považována za nejvýkonnější, nejcitlivější a kvantitativní metodu pro detekci hladin RNA v buňkách nebo tkáních.
SYBR Green a Taqman jsou dvě metody používané k detekci nebo sledování amplifikačního procesu PCR v reálném čase. Metoda SYBR Green se provádí pomocí fluorescenčního barviva zvaného SYBR green a detekuje amplifikaci navázáním barviva za vzniku dvouvláknové DNA. Taqman se provádí pomocí duálně značených sond a detekuje amplifikaci degradací sondy polymerázou Taq a uvolňováním fluoroforu, jak je znázorněno na obrázku 02. Obě metody monitorují postup amplifikačního procesu a hlásí množství produktu v reálném čase.
PCR v reálném čase má širokou škálu aplikací, jako je kvantifikace genové exprese, analýza mikroRNA a nekódující RNA, genotypizace SNP, detekce variant počtu kopií, detekce vzácných mutací, detekce geneticky modifikovaných organismů, detekce infekčních agens, atd.
Obrázek 02: Technika kvantitativní PCR
Jaký je rozdíl mezi RT PCR a QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR je technika používaná k detekci genové exprese amplifikací. | QPCR je technika, která amplifikuje DNA a kvantifikuje produkty PCR v reálném čase. |
| Zapojení enzymu reverzní transkriptázy | |
| Pro RT PCR se používá enzymová reverzní transkriptáza. | Enzymová reverzní transkriptáza se pro QPCR nepoužívá. |
| Použití fluorescenčně značených molekul | |
| Fluorescenčně značená barviva nebo sondy se pro RT PCR nepoužívají. | Pro QPCR se používají fluorescenčně značená barviva nebo sondy. |
| Kvantifikace produktu PCR | |
| Pokud není spojeno s QPCR, RT PCR nekvantifikuje produkt PCR. | QPCR kvantitativně měří produkt PCR. |
| Výchozí materiál | |
| Výchozí materiál je mRNA. | Výchozí materiál je DNA. |
| Syntéza cDNA | |
| Komplementární DNA je produkována během RT PCR. | Komplementární DNA se během QPCR nevytváří. |
Shrnutí – RT PCR vs QPCR
RT PCR a QPCR jsou dvě verze tradiční PCR. Technika RT PCR se provádí pro vzorky mRNA a je řízena reverzní transkripcí a produkcí cDNA. QPCR se používá ke kvantifikaci produktů PCR během tepelných cyklů PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv nebo značených sond. V QPCR je množství produktu PCR reprezentováno emitovanými fluorescenčními signály ze vzorku. RT PCR se běžně používá jako amplifikační proces, zatímco QPCR se běžně používá jako kvantifikační proces. Toto je rozdíl mezi RT PCR a QPCR.
