Klíčový rozdíl – RAPD vs RFLP
Genetické markery se v molekulární biologii používají k identifikaci genetických variací mezi jednotlivci a druhy. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) a polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) jsou dva důležité molekulární markery běžně používané v laboratořích. RAPD se provádí s krátkými a libovolnými oligonukleotidovými primery a je založeno na náhodné amplifikaci více míst v templátové DNA organismu. RFLP se provádí se specifickou restrikční endonukleázou a je založen na polymorfismu výsledných restrikčních fragmentů a hybridizaci. Klíčový rozdíl mezi RAPL a RFLP je v tom, že RAPD je typ PCR techniky prováděný bez předchozí znalosti sekvence, zatímco RFLP není zapojen do PCR a vyžaduje předchozí znalost sekvence k provedení této techniky.
Co je RAPD?
RAPD je užitečný molekulární marker v molekulární biologii. Je to rychlá a snadná technika. RAPD lze definovat jako metodu, která vede k polymorfním sekvencím DNA jako výsledek náhodné amplifikace více míst cílového templátu DNA. RAPD používá pro PCR amplifikaci krátké oligonukleotidové primery s libovolnými sekvencemi. Primery jsou uměle syntetizovány bez předchozí znalosti sekvence. Proto je považována za snadnou a užitečnou techniku.
Následující hlavní kroky zahrnují RAPD.
- Extrakce cílové DNA
- Amplifikace více lokalizací cílové DNA pomocí náhodně vybraných primerů
- Gelová elektroforéza amplifikovaných produktů PCR
- Barvení ethidium bromidem a identifikace polymorfismu
V důsledku variace v nasedání primeru se během amplifikace generují různé fragmenty s různou délkou. Vzory pruhů na gelech se tedy u jednotlivců a druhů liší. RAPD tedy umožňuje detekci genetických variací mezi organismy při identifikaci a diferenciaci.
RAPD se používá v různých studiích molekulární biologie, jako je identifikace genetických rozdílů mezi blízce příbuznými druhy, mapování genů, DNA fingerprinting, identifikace dědičných chorob atd.
Obrázek 01: RAPD
Co je RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) je molekulární marker používaný v molekulární biologii pro identifikaci genetických variací v homologních sekvencích DNA. Je to první genetický marker vyvinutý pro snímání DNA. Všechny organismy produkují jedinečné profily DNA, když jsou omezeny specifickými restrikčními enzymy. RFLP slouží jako důležitý nástroj při vytváření jedinečných profilů DNA jedinců a detekci genetických variací mezi nimi. Když jsou vzorky DNA štěpeny specifickými restrikčními endonukleázami, poskytují různé profily DNA, které jsou pro každého jedince jedinečné. Principem této metody je tedy detekce genetických variací mezi organismy restrikcí homologní DNA specifickými restrikčními enzymy a analýza polymorfismu délky fragmentů pomocí gelové elektroforézy a blotu. Vzorce blotování jsou jedinečné pro každý organismus a charakterizují specifické genotypy.
S RFLP souvisí následující kroky.
- Izolace dostatečného množství DNA ze vzorků
- Fragmentace vzorků DNA se specifickými restrikčními endonukleázami do krátké sekvence
- Separace výsledných fragmentů s různou délkou elektroforézou na agarózovém gelu.
- Přenos gelového profilu do membrány pomocí Southern blotting
- Hybridizace membrány se značenými sondami a analýza polymorfismu délky fragmentu v každém profilu
RFLP má různé aplikace, jako je diagnostika dědičných chorob, mapování genomu, kriminální identifikace ve forenzních studiích, testování otcovství atd.
Obrázek 02: RFLP genotypizace
Jaký je rozdíl mezi RAPD a RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD je molekulární marker založený na náhodných primerech a PCR. | RFLP je molekulární marker založený na produkci různě dlouhých restrikčních fragmentů. |
| Požadovaný vzorek | |
| Pro RAPD analýzu stačí malé vzorky DNA. | Pro analýzu RFLP je potřeba velké množství extrahovaného vzorku DNA. |
| Čas | |
| RAPD je rychlý proces. | RFLP je časově náročný proces. |
| Použití základního nátěru | |
| Používají se náhodné primery a stejné primery mohou být použity pro různé druhy. | V RFLP se pro hybridizaci používají druhově specifické sondy. |
| Spolehlivost | |
| Spolehlivost techniky je menší ve srovnání s RFLP. | RFLP je spolehlivá technika. |
| Blotting | |
| RAPD zahrnuje Southern blotting. | Southern blotting je jedním krokem RFLP. |
| Detekce alelické variace | |
| Alelické varianty nelze pomocí RAPD detekovat. | Alelické varianty lze detekovat RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD nevyžaduje předchozí znalost sekvence. | Pro návrh sondy je nutná předchozí znalost sekvence. |
| PCR | |
| PCR se podílí na RAPD | PCR se netýká RFLP. |
| Reprodukovatelnost | |
| RAPD má nízkou reprodukovatelnost | RFLP má ve srovnání s RAPD vysokou reprodukovatelnost. |
Shrnutí – RAPD vs RFLP
RAPD a RFLP jsou důležité markery používané v molekulární biologii. Obě metody jsou schopny detekovat genetické variace mezi organismy. RAPD se provádí pomocí náhodných primerů. RFLP se provádí pomocí specifických restrikčních enzymů. Obě metody vytvářejí profily DNA jedinečné pro jednotlivé organismy. RAPD zahrnuje srovnatelně málo kroků než RFLP. Poskytuje však méně spolehlivé a reprodukovatelné výsledky než RFLP. Toto je hlavní rozdíl mezi RAPD a RFLP.
