Klíčový rozdíl – teplá a studená trypsinizace
Teplá a studená trypsinizace jsou dvě metody používané při enzymatické disagregaci buněk při kultivaci živočišných buněk. Klíčový rozdíl mezi teplou a studenou trypsinizací, jak naznačují názvy, závisí na teplotě, při které se trypsin přidává pro buněčnou disagregaci. Teplá trypsinizace probíhá za vyšších teplotních podmínek (36,5 – 37 0C), zatímco studená trypsinizace probíhá za podmínek nízké teploty.
V procesu primární buněčné kultivace živočišných buněk se používají tři hlavní metody, které se osvědčily. Tyto tři metody zahrnují mechanickou disagregaci buněk, enzymatickou disagregaci buněk a techniku primárního explantátu. Enzymatická disagregace buněk vede k izolaci buněk a je prováděna enzymem degradujícím proteiny trypsinem. Proto je tento proces známý jako trypsinizace. Trypsinizace může být provedena za dvou různých podmínek, a to za teplé trypsinizace a studené trypsinizace. Teplá trypsinizace je metoda ošetření buněk trypsinem za teplých podmínek při teplotě 36,5 – 37 0C. Trypsinizace za studena je proces úpravy trypsinem, který probíhá za chladnějších podmínek, nejlépe v ledu s velmi nízkými teplotami.
Co je to teplá trypsinizace?
Trypsinizace může být provedena k disagregaci buněčných složek za účelem izolace buněk k produkci primární buněčné kultury. Trypsin je enzym degradující protein a směs enzymů použitá při trypsinizaci může být buď surový extrakt nebo purifikovaný produkt. Surový extrakt je údajně účinnější při lýze proteinů a rozpadu buněk, protože obsahuje další degradační enzymy.
Teplá trypsinizace je nejběžněji používaná enzymatická metoda pro desagregaci buněk, která probíhá za vyšších teplotních podmínek. Před ošetřením trypsinizací se požadovaná tkáň naseká na menší kousky. Usnadňuje proces snadné dezagregace. Nasekaná tkáň se poté promyje ve speciálním médiu známém jako médium Dissection Basal S alt.
Po dokončení promývacího kroku jsou buňky transformovány do baňky obsahující aktivní enzym, kterým je trypsin. Protože tato technika předpokládá protokol teplé trypsinizace, trypsin se umístí při teplotě kolem 37 0C po dobu asi čtyř hodin.
Obrázek 01: Trypsin
Obsah je míchán a promícháván pomocí centrifugačních metod pro usnadnění protokolu a pro urychlení procesu dezagregace. Jakmile je dosaženo doporučeného času, mohou být buňky odvozeny ze supernatantu. Buňky získané ze supernatantu jsou poté inkubovány při určité teplotě a čase.
Co je to studená trypsinizace?
Studená trypsinizace je další typ trypsinizace, který probíhá za chladných podmínek. Při této technice se buňky, které se nasekají a promyjí, umístí do lahviček na led a poté se namočí trypsinem. Doba namáčení je mnohem delší – asi 6 – 24 hodin.
Po dokončení namáčení se trypsin odstraní z buněčného lyzátu a kousky tkáně se dále inkubují při 37 0C po dobu asi 20 – 30 minut. Desagregace buněk se provádí opakovaným pipetováním tkáňové směsi. To umožní buňkám disociovat z membrány a dostat se do supernatantu. Jakmile jsou buňky v supernatantu, jsou inkubovány a pěstovány při požadované teplotě a časovém období.
Metoda trypsinizace za studena má několik výhod
- Vyšší výtěžek životaschopných buněk, protože poškození buněk je minimalizováno. Poškození buněk je minimalizováno tím, že se nepoužívá centrifugace.
- Vysoce pohodlná metoda.
- Méně pracné.
Hlavním omezením metody studené trypsinizace je, že nelze použít velké množství najednou.
Jaké jsou podobnosti mezi teplou a studenou trypsinizací?
- Procesy teplé i studené trypsinizace využívají enzym trypsin k desagregaci buněk.
- V postupech buněčné kultivace se pro disagregaci buněk používají teplé i studené trypsinizační procesy.
- Při ošetření trypsinizací za tepla i za studena se buňky získávají ze supernatantu.
Jaký je rozdíl mezi teplou a studenou trypsinizací?
Teplá vs studená trypsinizace |
|
| Teplá trypsinizace je metoda ošetření buněk trypsinem za teplých podmínek při teplotě 36,5 – 37 0. | Studená trypsinizace je proces úpravy trypsinem, který probíhá za chladnějších podmínek, nejlépe v ledu s velmi nízkými teplotami. |
| Protokol | |
| Nasekané kousky tkáně jsou udržovány při teplotě 37 0C nepřetržitě během celého postupu. | Nasekané kousky tkáně se nejprve udržují při ledově chladné teplotě a poté se udržují při teplotě 37 0. |
| Teplota | |
| Teplá trypsinizace probíhá při 36,5 – 37 0 | Studená trypsinizace probíhá při ledových teplotách. |
| Spotřebovaný čas | |
| Menší čas potřebný pro celý proces (kolem 4 hodin) teplé trypsinizace. | Vyžaduje delší čas (asi 6 – 24 hodin) pro studenou trypsinizaci. |
| Výtěžnost životaschopných buněk | |
| Nízká teplá trypsinizace. | Vysoká trypsinizace za studena. |
| Použití odstředění | |
| K disagregaci buněk při teplé trypsinizaci je nutná centrifugace. | Při studené trypsinizaci není vyžadována centrifugace. |
| Počáteční množství tkáně pro trypsinizaci | |
| Při teplé trypsinizaci lze použít větší množství tkáně. | Při studené trypsinizaci lze použít menší množství tkáně. |
| Poškození buňky | |
| Vysoký v důsledku centrifugace při teplé trypsinizaci. | Méně kvůli studené trypsinizaci. |
Shrnutí – Teplá versus studená trypsinizace
Trypsinizace je metoda použití enzymu rozkládajícího proteiny trypsin k disagregaci a přípravě primárních buněčných kultur během procesu buněčné kultivace. Existují dvě hlavní techniky trypsinizace založené na teplotách používaných během postupu. Jsou to teplá a studená trypsinizace. Trypsinizace za tepla se provádí při 37 0C, zatímco trypsinizace za studena se provádí za podmínek ledového chlazení. Ačkoli studená trypsinizace trvá déle, než je dokončena, říká se, že má vyšší výtěžek životaschopných buněk. To je způsobeno skutečností, že poškození buněk je minimalizováno při studené trypsinizaci, protože nepoužívá intenzivní centrifugační kroky. Toto je rozdíl mezi teplou a studenou trypsinizací.
