Klíčový rozdíl mezi náhodnými primery a oligo dT je v tom, že náhodný primer je směsí všech možných hexamerních oligonukleotidových sekvencí, zatímco primer oligo dT se skládá z jednovláknového úseku 12–18 deoxythymidinů.
Reverzní transkripce je mechanismus, při kterém může být cDNA syntetizována pomocí mRNA nebo jakéhokoli druhu RNA. K produkci cDNA by měl být poskytnut enzym reverzní transkriptázy a další nezbytné složky, zejména templát a primery. Primery jsou krátké sekvence DNA specificky navržené pro amplifikaci cílových sekvencí. Náhodné primery a oligo dT primery jsou dva běžné typy primerů používaných při reverzní transkripci. Náhodný primer nebo oligo dT primer jsou tedy krátké DNA oligonukleotidové sekvence potřebné pro reverzní transkriptázu k zahájení reverzní transkripce. V závislosti na templátu RNA lze z těchto dvou typů primerů vybrat vhodný primer.
Co jsou náhodné primery?
Náhodný primer je směs oligonukleotidů reprezentujících všechny možné hexamerní sekvence. Sekvence primeru náhodného primeru je 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T nebo C. Proto lze náhodné primery použít pro amplifikaci jednovláknové DNA nebo RNA pomocí DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy, respektive. Kromě toho je směs náhodných primerů schopna amplifikovat všechny oblasti RNA za vzniku cDNA. To znamená, že produkuje různé délky cDNA.
Obrázek 01: Náhodné primery
Nejdůležitější je, že náhodná směs primerů nevykazuje templátovou specificitu. Není schopen rozlišit mRNA a jiné druhy RNA. A žíhá s jakýmkoliv druhem RNA ve vzorku. Směs náhodných primerů je však vhodná pro reverzní transkripci RNA bez poly(A) konců, jako je rRNA, tRNA, nekódující RNA, malé RNA, prokaryotická mRNA atd., degradovaná RNA a RNA se známými sekundárními strukturami.
Co je Oligo dT?
Oligo dT primer je úsek 12 – 18 deoxythyminu (dT). Sekvence primeru může být reprezentována jako 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Používá se pro produkci cDNA z mRNA obsahující poly(A) ocas. V zásadě působí jako primer pro reakci katalyzovanou reverzní transkriptázou. Během reverzní transkripce se oligo dT primer nasedá s polyadenylovaným koncem nacházejícím se na 3' konci většiny eukaryotických mRNA a zahájí proces.
Obrázek 02: Reverzní transkripce pomocí Oligo dT Primer
Na rozdíl od náhodného primeru není oligo dT primer vhodný pro degradovanou RNA nebo RNA, které postrádají poly(A) konce, včetně prokaryotické RNA a mikroRNA.
Jaké jsou podobnosti mezi náhodnými primery a Oligo dT?
- Náhodný primer a oligo dT primer jsou dva typy primerů, které se používají při reverzní transkripci a tvorbě cDNA.
- Současné použití náhodného primeru a primeru oligo dT zvyšuje citlivost syntézy cDNA.
- Jsou to jednovláknové krátké nukleotidové sekvence.
Jaký je rozdíl mezi Random Primers a Oligo dT?
Náhodný primer je krátká oligonukleotidová sekvence složená z náhodné sekvence. Mezitím oligo dT primer je krátký řetězec složený z 12 až 18 deoxythymidinů. Toto je klíčový rozdíl mezi náhodnými primery a oligo dT. Sekvence náhodného primeru je 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T nebo C. Zatímco sekvence oligo dT primeru je 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´. Proto to můžeme považovat za další rozdíl mezi náhodnými primery a oligo dT.
Náhodné primery navíc nevykazují templátovou specificitu a nasedají s jakýmkoliv druhem RNA, zatímco oligo dT primery vykazují specificitu pro poly(A) konce eukaryotické mRNA.
Níže uvedená infografika shrnuje rozdíl mezi náhodnými primery a oligo dT.
Shrnutí – Random Primers vs Oligo dT
Náhodný primer a oligo dT primer jsou dva typy primerů používaných při syntéze cDNA. Náhodný primer se skládá ze směsi oligonukleotidů představujících všechny možné hexamerní sekvence, zatímco oligo dT primer je jednovláknová sekvence 12 až 18 deoxythymidinů. Toto je klíčový rozdíl mezi náhodnými primery a oligo dT. Kromě toho jsou oligo dT primery užitečné pro reverzní transkripci RNA v plné délce s poly(A) koncem, zatímco náhodné primery jsou užitečné pro reverzní transkripci většiny druhů RNA, včetně degradované RNA, RNA, která postrádá poly(A) konce a RNA obsahující sekundární struktury. Náhodný primer proto nevykazuje templátovou specificitu, zatímco oligo dT primer vykazuje specificitu vůči eukaryotické mRNA obsahující poly(A) konec.
