Klíčový rozdíl – severní vs jižní vs západní blotting
Detekce specifických sekvencí DNA, RNA a proteinů je nezbytná pro různé typy studií v molekulární biologii. Gelová elektroforéza je technika, která odděluje DNA, RNA a proteiny podle jejich velikosti. Z gelových profilů se detekuje konkrétní sekvence DNA, sekvence RNA nebo protein speciálními technikami nazývanými blotování a hybridizace se značenými sondami. Existují tři různé typy blotovacích metod, a to jižní, severní a západní. Klíčový rozdíl mezi severním jižním a západním přenosem spočívá v typu molekuly, kterou detekuje ze vzorku. Southern blotting je metoda, která detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA. Northern blotting je technika, která detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA. Western blotting je metoda, která detekuje specifický protein ze vzorku proteinu.
Co je Southern blotting?
Southern blotting techniku vyvinul E. M. Southern v roce 1975 pro identifikaci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA. Jedná se o první blotovací techniku zavedenou v molekulární biologii. Umožnil detekci specifických genů z DNA, specifických fragmentů z DNA atd. Technika Southern blotting zahrnuje několik kroků. Jsou následující.
- DNA je izolována ze vzorku a štěpena restrikčními endonukleázami.
- Natrávený vzorek je separován elektroforézou na agarózovém gelu.
- Fragmenty DNA v gelu jsou denaturovány do jednotlivých vláken použitím alkalického roztoku.
- Jednovláknová DNA je přenesena na nitrocelulózovou filtrační membránu kapilárním přenosem.
- Přenesená DNA je trvale fixována na membránu.
- Fixovaná DNA na membráně je hybridizována se značenými sondami.
- Nenavázaná DNA se z membrány smyje promytím.
- Rentgenový film se exponuje na membránu a připraví se autoradiograf.
Southern blotting se používá pro různé aspekty molekulární biologie. Je užitečný při mapování RFLP, forenzních studiích, metylaci DNA v genové expresi, detekci mutovaných genů u genetických poruch, snímání otisků DNA atd.
Obrázek 01: Technika Southern blotting
Co je Northern blotting?
Northern blotting je metoda navržená k detekci specifické sekvence RNA nebo sekvence mRNA ze vzorku ke studiu genové exprese. Tato technika byla vyvinuta Alwinem, Kempem a Starkem v roce 1979. Liší se od technik sourthern a western blotting v několika krocích. Tato technika se však také provádí pomocí gelové elektroforézy, blotu a hybridizace se specificky značenými sondami a detekcí. Technika Northern blotting se provádí následovně.
- RNA je extrahována ze vzorku a separována gelovou elektroforézou.
- RNA je přenesena z gelu na blotovací membránu a fixována.
- Membrána je ošetřena značenou sondou připravenou z cDNA nebo RNA (sonda je komplementární ke specifické sekvenci ve vzorku).
- Sonda je inkubována s membránou, aby se navázala se specifickou sekvencí.
- Nenavázané sondy jsou smyty.
- Hybridizované fragmenty jsou detekovány autoradiografem.
Northern blotting je důležitým nástrojem při detekci a kvantifikaci hybridizované mRNA, studiu degradace RNA, hodnocení poločasu RNA, detekci sestřihu RNA, studiu genové exprese atd.
Obrázek 02: Northern blotting
Co je Western blotting?
Western blotting je metoda detekce specifického proteinu ze směsi proteinů pomocí značené protilátky. Proto je western blot také známý jako imunoblot. Tato technika byla zavedena Towbinem a kol. v roce 1979 a nyní se běžně provádí v laboratořích pro analýzu proteinů. Kroky jsou následující.
- Proteiny jsou extrahovány ze vzorku
- Proteiny se oddělují podle velikosti pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu
- Oddělené molekuly jsou přeneseny do PVDF membrány nebo nitrocelulózové membrány elektroporací
- Membrána je blokována pro nespecifickou vazbu s protilátkami
- Přenesené proteiny jsou vázány s primární protilátkou (enzymem značené protilátky).
- Membrána se promyje, aby se odstranily nespecificky navázané primární protilátky
- Navázané protilátky se detekují přidáním substrátu a detekcí vytvořené barevné sraženiny
Western blotting je užitečný při detekci anti-HIV protilátek ve vzorku lidského séra. Western blot lze také použít jako potvrzující test na infekci hepatitidou B a definitivní test na nemoc šílených krav.
Obrázek 03: Western blotting
Jaký je rozdíl mezi Northern Southern a Western blotting?
Severní vs. Jižní vs. Western blotting |
|
| Zjištěný typ molekuly | |
| Northern Blotting | Northern blotting detekuje specifickou sekvenci RNA ze vzorku RNA. |
| Southern blotting | Southern blotting detekuje specifickou sekvenci DNA ze vzorku DNA. |
| Western blotting | Western blotting detekuje specifický protein ze vzorku proteinu. |
| Typ gelu | |
| Northern Blotting | Toto používá agarózový/formaldehydový gel. |
| Southern blotting | Toto používá agarózový gel. |
| Western blotting | Toto používá polyakrylamidový gel. |
| Metoda blotování | |
| Northern Blotting | Toto je kapilární přenos. |
| Southern blotting | Toto je kapilární přenos. |
| Western blotting | Toto je elektrický převod. |
| Použité sondy | |
| Northern Blotting | sondy cDNA nebo RNA značené radioaktivně nebo neradioaktivně. |
| Southern blotting | Sondy DNA jsou označeny radioaktivně nebo neradioaktivně. |
| Western blotting | Primární protilátky se používají jako sondy. |
| Detekční systém | |
| Northern Blotting | To se provádí pomocí autoradiografu nebo detekce změny světla nebo barvy. |
| Southern blotting | To se provádí pomocí autoradiografu, detekce světla nebo změny barvy. |
| Western blotting | To se provádí pomocí detekce změny světla nebo barvy. |
Shrnutí – severní vs. jižní vs. západní blotting
Blotting je speciální technika vyvinutá pro identifikaci specifické DNA, RNA nebo proteinu ze vzorků. Pro detekci specifického typu molekuly existují tři samostatné blotovací postupy, jmenovitě severní, jižní a západní. Technika Northern blotting je navržena pro detekci specifické sekvence RNA ze směsi RNA. Technika Southern blotting umožňuje detekci specifické sekvence DNA ze vzorku DNA a technika Western blotting je vyvinuta k identifikaci specifického proteinu ze směsi proteinů.
