Klíčový rozdíl – Dopředný vs. Reverzní primer
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda amplifikace DNA, která se používá v molekulárně biologických aplikacích. Je to běžně používaná technika, která vytváří miliony až miliardy kopií zvláště zajímavé sekvence DNA. Jde o metodu in vitro prováděnou v laboratořích. Technika PCR je zcela závislá na komerčně vyráběné DNA polymeráze zvané Taq polymeráza. A také vyžaduje několik dalších součástí a správné udržování teploty. Jednou z důležitých složek jsou primery. Primery jsou krátké sekvence DNA specificky navržené pro cílovou sekvenci DNA. Obvykle mají délku kolem 20 nukleotidů. Taq polymeráza katalyzuje přidávání nukleotidů do již existující nukleotidové sekvence. Primery tedy slouží jako výchozí body syntézy nových vláken. Taq polymeráza pracuje pouze ve směru 5' až 3', takže syntéza DNA probíhá ve stejném směru 5' až 3'. Protože DNA je dvouvláknová, jsou v PCR potřeba dva typy primerů. Jsou známé jako dopředný primer a reverzní primer. Přímé a reverzní primery se nazývají na základě směru prodloužení primeru v DNA, když dochází k syntéze DNA. Dopředný primer nasedá s antisense řetězcem DNA a iniciuje syntézu kladného řetězce genu ve směru 5' až 3'. Reverzní primer nasedá se sense vláknem a iniciuje syntézu komplementárního vlákna kódujícího vlákna; což je –ve řetězec genu ve směru 5' až 3'. Toto je klíčový rozdíl mezi dopřednými a zpětnými primery.
Co je to dopředný primer?
Dopředná orientace je syntéza kódujícího řetězce nebo sense řetězce genu. Taq polymeráza katalyzuje syntézu nového vlákna ve směru 5' až 3'. K syntéze kódujícího řetězce dochází, když primer nasedá s nekódujícím nebo antisense řetězcem a prodlužuje se ve směru 5' až 3'.
Obrázek 01: Dopředné a zpětné primery
Primér, který nasedá s antisense vláknem nebo nekódujícím vláknem nebo templátovým vláknem, je známý jako dopředný primer, protože dopředný primer funguje jako výchozí bod k syntéze kódujícího nebo pozitivního řetězce genu. Dopředný primer má krátkou nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k 3' přilehlému konci antisense řetězce. Hybridizuje se s antisense vláknem a usnadňuje Taq polymeráze přidání nukleotidů, které jsou komplementární k templátovému vláknu.
Co je reverzní primer?
Reverzní primer je krátká sekvence DNA, která nasedá s 3' koncem sense řetězce nebo kódujícího řetězce. Reverzní primer slouží jako výchozí bod pro syntézu komplementárního řetězce kódující sekvence nebo nekódující sekvence. Reverzní primer je navržen jako komplementární k 3' konci kódujícího řetězce. Proto žíhá s přilehlým 3' koncem kódujícího řetězce a umožňuje Taq polymeráze syntetizovat antisense řetězec nebo templátový řetězec. Protože jeho orientace je obrácená, je tento primer označen jako reverzní primer.
Reverzní i dopředné primery jsou důležité pro produkci milionů až miliard kopií konkrétních oblastí DNA, které jsou cílené nebo zajímající se.
Jaké jsou podobnosti mezi dopředným a zpětným primerem?
- Dopředné i zpětné primery jsou vyrobeny z oligonukleotidů.
- Dopředné i reverzní primery mají krátkou nukleotidovou sekvenci komplementární k přilehlým koncům dvouřetězců DNA.
- Dopředné i zpětné primery se obvykle skládají z 20 nukleotidů.
- Při polymerázových řetězových reakcích se používají dopředné i reverzní primery.
- Dopředné i zpětné primery jsou syntetizovány komerčně.
- Primery Forward i Reverse jsou teplotně stabilní a normálně mají podobnou Tm.
- Dopředné i reverzní primery jsou spojeny s cílovými sekvencemi DNA.
- Dopředné i reverzní primery jsou navrženy podle reakcí PCR.
- Dopředný i reverzní primer slouží jako výchozí body pro amplifikaci DNA.
- Reverzní i dopředné primery jsou důležité pro produkci milionů kopií konkrétních oblastí cílových nebo zainteresovaných sekvencí DNA.
Jaký je rozdíl mezi dopředným a zpětným primerem?
Dopředný primer vs. Reverzní primer |
|
| Dopředný primer je krátká sekvence DNA, která hybridizuje s 3' koncem nekódujícího nebo templátového řetězce genu a slouží jako výchozí bod pro syntézu kódující sekvence. | Reverzní primer je krátká sekvence DNA, která hybridizuje s 3' koncem kódujícího nebo netemplátového řetězce a slouží jako výchozí bod pro syntézu nekódující sekvence. |
| Žíhací vlákno | |
| Dopředný primer žíhá se šablonou. | Reverzní primer žíhá s netemplátovým vláknem. |
| Výsledná nová sekvence | |
| Dopředný primer usnadňuje syntézu kódující sekvence. | Reverzní primer usnadňuje syntézu nekódující sekvence. |
Shrnutí – Dopředný vs. Reverzní primer
Technika PCR zahrnuje dva typy primerů. Jsou to dopředné a zpětné primery. Na základě prodloužení primeru při syntéze nového řetězce DNA jsou tyto primery označeny nebo pojmenovány. Taq polymeráza syntetizuje novou DNA v orientaci 5' až 3'. Primery jsou tedy navrženy jako komplementární k 3' koncům dvouřetězců. Dopředný primer, který se prodlužuje ve směru 5' až 3', hybridizuje s 3' koncem antisense nebo templátu nebo nekódující sekvence. Slouží jako výchozí bod pro syntézu kódující sekvence. Reverzní primer, který se prodlužuje ve směru 5' až 3', hybridizuje s 3' koncem kódujícího nebo netemplátového nebo sense vlákna. Slouží jako výchozí bod pro syntézu nekódující sekvence. Toto je rozdíl mezi dopředným a zpětným impulsem.
