Klíčový rozdíl – stránka SDS a nativní stránka
SDS a nativní stránka jsou dva typy technik elektroforézy na polyakrylamidovém gelu používané v molekulární biologii. Klíčovým rozdílem mezi SDS Page a Native Page je typ použitého polyakrylamidového gelu. V SDS Page je použit denaturační gel, proto jsou molekuly separovány na základě jejich molekulové hmotnosti. Naproti tomu v Native Page se používají nedenaturační gely. Proto jsou molekuly separovány na základě jejich velikosti, náboje a tvaru.
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (Page) využívá gel vyrobený polymerací akrylamidových monomerů s methylenbisakrylamidem. Polyakrylamid je houževnatější a tepelně stabilnější než agaróza. Polyakrylamidové gely mají menší velikost pórů, což umožňuje účinnou separaci proteinů. Existují dva hlavní typy nastavení stránky, a to SDS Page a Nativní stránka. SDS Page nebo Sodium-Dodecyl Sulfate Polyakrylamidová gelová elektroforéza odděluje proteiny na základě jejich molekulových hmotností. Denaturační gely jsou použity na stránce SDS. Native Page používá nedenaturační gely a separuje proteiny na základě jejich velikosti, náboje a tvaru (3D konformace).
Co je stránka SDS?
SDS Page je nejběžnější elektroforetická technika používaná k separaci proteinů na základě jejich molekulové hmotnosti. Gel se vyrábí přidáním SDS (dodecylsulfát sodný), což je detergent. SDS protézuje proteiny na monomery. SDS je aniontový detergent. Proto dodává proteinům čistý negativní náboj v širokém rozmezí pH. Když se na molekuly proteinu udělí čistý negativní náboj, v důsledku kolísání náboje se složité struktury rozloží. V důsledku negativního náboje se proteiny přitahují ke kladnému konci. Molekuly s nižší molekulovou hmotností se tedy pohybují rychleji po gelové matrici a lze je pozorovat blízko anody, zatímco proteiny s vyšší molekulovou hmotností jsou pozorovány blíže k jamkám.
Obrázek 01: Strana SDS
Vazba SDS na polypeptidový řetězec je úměrná jeho relativní molekulové hmotnosti. Proto může být molekulová hmotnost stanovena také pomocí SDS Page. Barvení gelů SDS Page se provádí barvením bromfenolovou modří. Aplikace SDS page dosahují ve větším rozsahu, kde mohou být použity k odhadu relativní molekulové hmotnosti a ke stanovení relativního množství proteinů v proteinové směsi. SDS Page lze také použít ke stanovení distribuce proteinů ve směsi proteinů. SDS Page se také používá k čištění a hodnocení proteinů. Používá se jako předběžný postup pro western blotování a hybridizaci, která se zase používá pro mapování a identifikaci proteinů.
Co je nativní stránka?
Native Polyakrylamidová gelová elektroforéza (Native Page) využívá nedenaturující gel. Proto se do gelové matrice nepřidává SDS ani jiné denaturační činidlo. V Native Page je separace proteinů založena na náboji a velikosti proteinu. Proto mobilita proteinu závisí na náboji a velikosti proteinu.
Náboj proteinu závisí na postranních řetězcích aminokyselin. Pokud jsou postranní řetězce záporně nabité, protein obdrží celkově záporný náboj a naopak. Proteiny si zachovávají 3D konformaci díky skládání, ke kterému dochází. Skládání je výsledkem několika typů vazeb v proteinech, jako jsou disulfidové vazby, hydrofobní interakce a vodíkové vazby. Pokud je tedy nativní Page neseno při neutrálním pH, budou proteiny separovány podle molekulárního tvaru proteinu. Proto lze Native Page použít jako citlivou techniku k detekci změny náboje nebo konformace proteinu.
Hlavní výhodou nativní stránky je, že protein použitý pro analýzu stránky lze po analýze stránky získat v původním stavu, protože bílkovina není během procesu narušena. Native Page je technika s relativně vysokou propustností a stabilita proteinu je zvýšena.
Obrázek 02: Nativní stránka
Po dokončení gelového běhu lze gel Native Page zobrazit barvením bromfenolovou modří nebo jakýmkoli jiným vhodným barvicím činidlem. Aplikace Native Page zahrnují separaci kyselých proteinů včetně glykoproteinů, jako je lidský rekombinantní erytropoetin, nebo identifikaci proteinů přítomných v bovinním sérovém albuminu (BSA).
Jaké jsou podobnosti mezi stránkou SDS a nativní stránkou?
- Systém SDS Page i Native Page používají polyakrylamidový gel jako matrici gelu.
- Oba se používají pro separaci a identifikaci proteinů.
- Oba využívají k oddělení sloučenin elektroforetickou mobilitu.
- Obojí lze provést vertikálním způsobem nebo horizontálním způsobem (většinou jako vertikální nastavení stránky, protože délka běhu je delší).
- Pro provoz obou technik je nutný elektroforetický přístroj včetně nádržky na gel, hřebenů a napájení.
- Vizualizace gelu může být provedena metodami barvení v obou technikách.
Jaký je rozdíl mezi stránkou SDS a nativní stránkou?
Stránka SDS vs nativní stránka |
|
| SDS Page nebo Sodium-dodecylsulfát Page odděluje proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti a používá denaturační gel. | Native Page používá nedenaturační gely a odděluje proteiny na základě jejich velikosti, náboje a tvaru (3D konformace). |
| Typ gelu | |
| Na stránce SDS je použit denaturační gel. | Na nativní stránce je použit nedenaturační gel. |
| Přítomnost SDS | |
| SDS je přítomen jako detergent, který dodává vzorku na stránce SDS záporný náboj. | SDS se nenachází na nativní stránce. |
| Základ oddělení | |
| Separace proteinů závisí na molekulové hmotnosti proteinu na stránce SDS. | Separace závisí na velikosti a tvaru molekuly proteinu na nativní stránce. |
| Stabilita bílkovin | |
| Stabilita proteinu je na stránce SDS nízká. | Stabilita bílkovin je na nativní stránce vysoká. |
| Obnovení původního proteinu | |
| Není možné, protože je na stránce SDS denaturován. | Možné na nativní stránce. |
Shrnutí – stránka SDS vs nativní stránka
SDS Page a Native Page jsou dva typy technik elektroforézy na polyakrylamidovém gelu používané k separaci proteinů. Stránka SDS je ošetřena detergentem zvaným SDS. SDS uděluje proteinu celkový negativní náboj, který pak vede k denaturaci proteinu. Proto jsou proteiny separovány na základě jejich molekulové hmotnosti. Oproti tomu technika Native Page nepoužívá žádné denaturační činidlo. Proteiny jsou tedy buď separovány na základě jejich velikosti nebo tvaru. Toto je rozdíl mezi stránkou SDS a nativní stránkou.
