Klíčový rozdíl – cDNA vs genomická knihovna
Existují dva hlavní typy knihoven DNA vytvořených vědci pomocí technik genetického inženýrství. Jsou to knihovna cDNA a knihovna Genomic. Klíčový rozdíl mezi cDNA a genomickou knihovnou je v tom, že knihovna cDNA obsahuje klonovanou komplementární DNA celkové mRNA organismu, zatímco knihovna genomové DNA obsahuje klonované fragmenty celého genomu organismu. Knihovna genomové DNA je větší než knihovna cDNA.
Co je genomická knihovna?
Knihovna genomové DNA je sbírka klonů nesoucích fragmenty celkové genomové DNA organismu. Obsahuje celou genomovou DNA tohoto organismu, včetně kódujících a nekódujících sekvencí. Konstrukce genomové knihovny se provádí technologií rekombinantní DNA s následným klonováním (genetické inženýrství). Konstrukce zahrnuje různé kroky, jak je znázorněno na obrázku 01. Proces začíná izolací genomové DNA. Pomocí vhodného protokolu extrakce DNA by měla být izolována celková genomová DNA organismu. Poté by měla být DNA přeměněna na zvládnutelné velikosti nebo na specifické fragmenty restrikčními endonukleázami (enzymy štěpícími DNA). Fragmentovaná DNA by měla být vložena do vektorů pomocí DNA ligáz (DNA spojovací enzymy). Vektor je sebereplikující se organismus. Plazmidy a bakteriofágy jsou běžně používané vektory v technologii rekombinantní DNA. Tyto ligované vektory jsou známé jako rekombinantní molekuly DNA, protože nesou jak vlastní, tak vložené sekvence DNA. Rekombinantní vektory jsou přidány k hostitelské bakterii a připraveny k absorpci rekombinantních vektorů uvnitř bakteriální buňky. Bakterie s rekombinantními vektory (plazmidy) by měly být pěstovány v kultivačním médiu. Během množení bakterií bakteriální DNA spolu s rekombinantními plazmidy replikují své genomy a vytvářejí klony. Tyto klony obsahují celý genom zdrojového organismu. Proto se nazývá genomická knihovna. Plazmidy lze snadno oddělit od bakteriální chromozomální DNA za účelem konstrukce genomové knihovny tohoto organismu. Pokud konkrétní organismus obsahuje zainteresované geny, je snadné jej detekovat v genomové knihovně hybridizací pomocí molekulárních sond (markerů).
Genomické knihovny jsou důležité pro studium genomové struktury a funkce, specifických genů, umístění genů, mapování genů, mutací, sekvenování genů, identifikaci nových terapeutických genů atd.
Obrázek_1: Konstrukce genomické knihovny
Co je knihovna cDNA?
Knihovna cDNA je sbírka klonů komplementární DNA (cDNA) syntetizovaných z celkové mRNA organismu. Postup výstavby zahrnuje různé kroky. Purifikace celkové mRNA z organismu je prvním zahrnutým krokem. Izolovaná mRNA se převádí na vlákna cDNA procesem zvaným reverzní transkripce. Reverzní transkripci usnadňuje enzym zvaný reverzní transkriptáza. Používá malý 3' primer a iniciuje syntézu prvního cDNA vlákna komplementárního k templátovému vláknu mRNA. Výsledná dvouřetězcová cDNA se převede na menší fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz a vloží se do vhodných vektorů. Tyto zkonstruované rekombinantní molekuly jsou pak přidány do hostitelského organismu a pěstovány v kultivačním médiu za vzniku klonů. Soubor klonů obsahujících cDNA fragmenty organismu je známý jako cDNA knihovna. Plně rozřezaná zralá mRNA neobsahuje introny a regulační oblasti. Proto nekódující fragmenty nejsou přítomny v cDNA knihovnách na rozdíl od genomové knihovny.
Knihovny cDNA jsou důležité pro analýzu kódujících oblastí, genových funkcí, expresi genů atd.
Obrázek_2: Konstrukce knihovny cDNA
Jaký je rozdíl mezi cDNA a Genomic Library?
cDNA vs genomická knihovna |
|
| Knihovna cDNA je sbírka klonů nesoucích komplementární DNA k mRNA organismu | Genomická knihovna je sbírka klonů nesoucích celkovou genomickou DNA organismu. |
| Kódování vs nekódující sekvence | |
| Knihovna cDNA obsahuje pouze kódující sekvence; neobsahuje introny. | Genomická knihovna se skládá z celé genomové DNA včetně nekódující (introny a regulační) DNA. |
| Velikost | |
| Knihovna cDNA je malá. | Genomická knihovna je velká. |
| Výchozí materiál | |
| Výchozí materiál je mRNA | Výchozím materiálem je DNA. |
| Zapojení zpětného přepisu. | |
| Reverzní transkripce probíhá při syntéze prvního řetězce cDNA. | Reverzní přepis neprobíhá. |
Shrnutí – cDNA a genomická knihovna
Genomová knihovna představuje populaci klonů nesoucích fragmentovanou celkovou genomickou DNA organismu. cDNA knihovna představuje populaci klonů nesoucích komplementární DNA celkové mRNA organismu. Klon cDNA obsahuje pouze sekvence nalezené v mRNA, zatímco genomický klon obsahuje sekvence celého genomu. Toto je rozdíl mezi cDNA a genomickou knihovnou.
