Klíčový rozdíl mezi Klenowovou a T4 DNA polymerázou je ten, že Klenowův fragment je velký fragment E. coli DNA polymerázy 1, zatímco T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza 1 bakteriofága T4.
DNA polymerázy jsou enzymy, které katalyzují tvorbu DNA přidáním deoxyribonukleotidů na 3′-OH konec již existujícího primeru. Existují různé typy DNA polymeráz. Většina DNA polymeráz používaných v molekulární biologii jsou prokaryotické DNA polymerázy. Klenowův fragment a T4 DNA polymeráza jsou dva typy DNA polymeráz, které mají prokaryotický původ. Klenowův fragment je velký fragment, který vzniká štěpením E.coli DNA polymerázu 1 na dva fragmenty bakteriální proteázou subtilisin. T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza 1 bakteriofága T4. Klenow i T4 DNA polymeráza mají 5′→3′ polymerázovou a 3′→5′ exonukleázovou aktivitu. Oběma chybí 5′→3′ exonukleázová aktivita, díky čemuž jsou vhodnější pro mnoho aplikací v molekulární biologii.
Co je Klenow?
Klenowův fragment je DNA polymeráza, která je užitečná v molekulární biologii. Když E. coli DNA polymeráza 1 prochází proteolytickým štěpením bakteriální proteázou, subtilisinem, výsledkem jsou dva fragmenty: jeden je velký fragment a druhý je malý fragment. Klenowův fragment je velký fragment, který má velikost 68 kDa. Klenowův fragment má 5′→3′ polymerázové a 3′→5′ exonukleázové (korekturní) aktivity DNA Pol I. 3′→5′ exonukleázová aktivita Klenowova fragmentu usnadňuje odstranění nesprávně přidaných bází v průběhu polymerace. Klenow fragment neobsahuje 5′→3′ exonukleázovou aktivitu, která je ukázána u plné délky nebo intaktní E.coli DNA polymeráza 1. Je výhodné, když je potřeba pouze samotná polymerační aktivita. Klenowovy fragmenty se používají k vyplnění 5' převisů, syntéze sond, sekvenování DNA, syntéze dvouvláknové DNA, syntéze druhého vlákna cDNA a místně cílené mutagenezi.
Obrázek 01: Klenowův fragment
V určitých aplikacích se také 3′→5′ exonukleázová aktivita Klenowova fragmentu stává nežádoucí. Může být odstraněn zavedením mutace do genu, který kóduje Klenow fragment. Výsledný Klenow fragment je známý jako exo-Klenow fragment. Exo-Klenow fragment má tedy pouze 5′→3′ polymerázovou aktivitu E. coli polymerázy 1.
Co je T4 DNA polymeráza?
T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza, která katalyzuje syntézu DNA. Je to protein kódovaný bakteriofágem T4. Strukturně je T4 DNA polymeráza protein o 898 aminokyselinových zbytcích (molekulová hmotnost 103,6 kDa). Ke katalýze syntézy je zapotřebí šablona a primer.
Obrázek 02: T4 DNA polymeráza
Podobně jako Klenowův fragment má T4 DNA polymeráza jak 5′→3′ polymerázové, tak 3′→5′ exonukleázové aktivity. Navíc také postrádá 5′→3′ exonukleázovou aktivitu. T4 DNA polymeráza je užitečná při vyplňování 5′-vyčnívajících konců fragmentů DNA. Často se také používá k 5'- nebo 3'-koncovému značení dvouřetězcové DNA. T4 DNA polymeráza se často používá při tupém klonování. 3′→5′ exonukleázová (kontrolní) aktivita T4 DNA polymerázy je silnější (více než 200krát) než Klenowův fragment. Nejdůležitější je, že T4 DNA polymeráza má vysokou zpracovatelnost (400 nukleotidů za sekundu).
Jaké jsou podobnosti mezi Klenowem a T4 DNA polymerázou?
- Klenow a T4 DNA polymeráza jsou dvě prokaryotické polymerázy.
- Obě polymerázy mají 5′→3′ polymerázovou a 3′→5′ exonukleázovou aktivitu.
- Nevykazují 5′→3′ exonukleázovou aktivitu.
- Oba enzymy vyžadují templát a primer, aby katalyzovaly syntézu DNA.
- Tyto enzymy lze tepelně inaktivovat při 75 0
Jaký je rozdíl mezi Klenowem a T4 DNA polymerázou?
Klíčovým rozdílem mezi Klenowovou a T4 DNA polymerázou je původ každého enzymu. Klenow fragment pochází z bakterie, zatímco T4 DNA polymeráza pochází z bakteriofága, což je virus. T4 DNA polymeráza má vyšší zpracovatelnost než Klenowův fragment. Kromě toho má T4 DNA polymeráza silnou korekční aktivitu než Klenowův fragment. Toto je další rozdíl mezi Klenowem a T4 DNA polymerázou.
Níže uvedená infografika uvádí další rozdíly mezi Klenowovou a T4 DNA polymerázou v tabulkové formě.
Shrnutí – Klenow vs T4 DNA polymeráza
Klenowův fragment je velký fragment E. coli DNA polymerázy 1. Má pouze 5′→3′ polymerázové a 3′→5′ exonukleázové aktivity. Postrádá 5′→3′ exonukleázovou aktivitu intaktní DNA E. coli pol 1. Klenow fragment je tedy bakteriální polymeráza. Na druhé straně T4 DNA polymeráza je polymeráza kódovaná bakteriofágem T4. Podobně jako Klenowův fragment obsahuje jak 5′→3′ polymerázové aktivity, tak 3′→5′ exonukleázové aktivity a postrádá 5′→3′ exonukleázovou aktivitu. T4 DNA polymeráza má však vysokou zpracovatelnost a vysokou korektorskou aktivitu než Klenowův fragment. Toto je klíčový rozdíl mezi Klenowovou a T4 DNA polymerázou.
