Klíčový rozdíl mezi Golden Gate a Gibson Assembly je ten, že Golden Gate spoléhá na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována, zatímco Gibson Assembly se nespoléhá na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, aby být klonován.
Během posledních desetiletí vyvinuli molekulární vědci různé standardizované postupy, které umožňují snadnější sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu. Proto jsou klonovací metody, jako je ligace restrikčních enzymů, klonování brány, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly a TOPO Cloning, široce používány výzkumníky ve vědeckých experimentech. Golden Gate a Gibson Assembly jsou tedy dvě metody molekulárního klonování, které umožňují sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu.
Co je shromáždění Golden Gate?
Golden Gate je metoda molekulárního klonování, která usnadňuje sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu. Tato metoda se opírá o přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována. Vznikla v roce 1996. Tato technika využívá restrikční enzymy typu IIS a T4 DNA ligázu. Tyto enzymy štěpí DNA mimo rozpoznávací místa. Mohou vytvářet nepalindromické převisy. Proto lze pomocí kombinací převislých sekvencí sestavit více fragmentů DNA.
Obrázek 01: Golden Gate
Postup montáže zlaté brány
Technika zlaté brány má ve svém postupu hlavní tři kroky:
- vytvoření převisů v klonovacím vektoru,
- sestavení více inzertů DNA pomocí fragmentově specifických sekvencí v převisech a
- ligace.
Sestava Zlaté brány používá kruhové klonovací vektory (cílový vektor). Kromě toho je v tomto způsobu restrikční místo eliminováno z ligovaného produktu, aby se provedlo štěpení a ligace současně. Typický protokol tepelného cyklu pro Golden Gate osciluje mezi 37 °C a 16 °C, protože 37 °C je optimální pro restrikční enzymy a 16 °C je optimální pro ligázy.
Co je Gibson Assembly?
Gibson Assembly je metoda molekulárního klonování, která umožňuje sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu. Na rozdíl od metody Golden Gate se tato metoda nespoléhá na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována. Nalezl jej Daniel G. Gibson z Institutu J. Craiga Ventera. Tato technika je typem metody klonování nezávislého na sekvenci a ligáze (SLIC).
Obrázek 02: Sestava Gibson
Postup montáže Gibson
Gibson Assembly potřebuje fragmenty DNA obsahující 20-40 párů bází překrývajících se se sousedními fragmenty DNA. Přesahy se přidávají pomocí PCR. Poté jsou tyto fragmenty DNA přidány do směsi Gibson maser, která má tři enzymy. Tento postup se provádí za izotermických podmínek (50 °C po dobu 1 hodiny) za použití tří různých enzymů: exonukleázy, DNA polymerázy a DNA ligázy. Exonukleáza žvýká zpět DNA z 5' konce. Neinhibuje tedy aktivitu polymerázy a umožňuje, aby reakce probíhala v jediném procesu. Výsledné jednořetězcové oblasti na sousedních fragmentech DNA mohou být spojeny díky překrývajícím se sekvencím. DNA polymeráza vyplní mezery přidáním nukleotidů. Nakonec se DNA ligáza kovalentně spojí s DNA sousedních segmentů. Normálně Gibson Assembly používá linearizované cílové vektory. Navíc tato metoda může současně kombinovat až 15 fragmentů DNA na základě podobnosti sekvence.
Podobnosti mezi Golden Gate a Gibson Assembly
- Golden Gate a Gibson Assembly jsou dvě metody molekulárního klonování.
- Obě metody mohou sestavit více fragmentů DNA do jednoho kusu.
- Tyto metody používají cílové vektory.
- Obě metody využívají tepelné cyklery pro sestavení více fragmentů DNA.
- Používají se při místně cílené mutagenezi.
Rozdíl mezi Golden Gate a Gibson Assembly
Golden Gate je metoda molekulárního klonování používaná při sestavování více fragmentů DNA do jednoho kusu, spoléhající na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována, zatímco Gibson Assembly je metoda molekulárního klonování používaná v sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu bez spoléhání se na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována. Toto je klíčový rozdíl mezi Golden Gate a Gibson Assembly. Kromě toho metoda Golden Gate používá kruhový cílový vektor, zatímco metoda Gibson Assembly používá linearizovaný vektor cíle.
Následující infografika uvádí rozdíl mezi Golden Gate a Gibson Assembly.
Shrnutí – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekulární klonování je metoda používaná k sestavení molekul rekombinantní DNA a řízení jejich replikace v hostitelských organismech. Golden Gate a Gibson Assembly jsou dvě metody molekulárního klonování, které umožňují sestavení více fragmentů DNA do jednoho kusu. Metoda Golden Gate spoléhá na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována, zatímco Gibson Assembly se nespoléhá na přítomnost restrikčních míst v konkrétní sekvenci, která má být klonována. Toto je klíčový rozdíl mezi Golden Gate a Gibson Assembly.
